[发明专利]用于肝细胞培养及肝脏类器官制备的培养基

权利要求书

1.一种无血清肝细胞培养基，其以用于哺乳动物细胞生长的培养基为基础培养基，添加有补充L-谷氨酰胺的试剂、维持培养基pH值稳定的pH值调节剂、原代细胞培养抗生素、血清替代物、N-乙酰半胱氨酸、生长因子、烟酰胺、Wnt激动剂、BMP抑制剂和Rock信号通路抑制剂，

其中，所述生长因子包括EGF、FGF10和FGF2，所述Wnt激动剂选自R spondin和/或Wnt3a，所述BMP抑制剂包括Noggin和A-83-01，所述Rock信号通路抑制剂包括Y27632。

2.如权利要求1所述的无血清肝细胞培养基，其特征在于，所述细胞培养基添加有P38信号通路抑制剂和cAMP激活剂中的一种或两种。

3.如权利要求1所述的无血清肝细胞培养基，其特征在于，所述基础培养基为改进DMEM/F12或改进RPMI培养基。

4.如权利要求1所述的无血清肝细胞培养基，其特征在于，所述Rock信号通路抑制剂选自Y 27632、HA1077和H 1152中的一种或多种。

5.如权利要求2所述的无血清肝细胞培养基，其特征在于，所述P38信号通路抑制剂选自SB203580，Doramapimod，SB202190，LY2228820，VX-702，PH-797804，VX-745，TAK-715，BMS-582949，Losmapimod，Pexmetinib和Skepinoe-L中的一种或多种。

6.如权利要求2所述的无血清肝细胞培养基，其特征在于，所述cAMP激动剂为Forskolin。

7.如权利要求1-6中任一项所述的无血清肝细胞培养基，其特征在于，

所述BMP抑制剂在所述培养基中的终浓度在0.5-800ng/ml培养基的范围内；

每种Wnt激动剂的终浓度为1-1500ng/ml培养基；

所述生长因子的终浓度为1-1000ng/ml培养基；

所述Rock信号通路抑制剂的终浓度在0.5-50µM的范围内；

所述P38信号通路抑制剂的终浓度为1-20 µM；

所述cAMP激动剂的终浓度为1-200μM。

8.如权利要求1所述的无血清肝细胞培养基，其特征在于，所述细胞培养基为细胞增殖培养基，包含作为BMP抑制剂的 Noggin和A-83-01，作为有丝分裂生长因子的EGF、FGF10和FGF2，作为Wnt 激动剂的R spondin，以及作为Rock信号通路抑制剂的Y 27632，并补充有GlutaMAX-I、维持培养基pH值稳定的pH值调节剂、原代细胞抗生素、B27血清替代物、烟酰胺和N-乙酰半胱氨酸。

9.如权利要求8所述的无血清肝细胞培养基，其特征在于，所述培养基还含有作为P38抑制剂的SB202190和作为cAMP激活剂的Forskolin中的任意一种或两种。

10.如权利要求8-9中任一项所述的无血清肝细胞培养基，其特征在于，Noggin的终浓度为5-15ng/ml；A-83-01的终浓度为300-800ng/ml；EGF的终浓度为20-80ng/ml；FGF10的终浓度为5-15ng/ml；FGF2的终浓度为0.1-2ng/ml；R spondin的终浓度为50-150ng/ml；Y27632的终浓度为5-15μM；SB202190的终浓度为5-15μM；cAMP激活剂的终浓度为5-15μM；Wnt3a的终浓度为300-600ng/ml。

11.一种试剂盒，其含有权利要求1-10中任一项所述的培养基。

12.如权利要求11所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还含有细胞外基质。