[发明专利]去除植物叶片中总叶绿素干扰H2

说明书

本发明公开了一种去除植物叶片中总叶绿素干扰H₂S含量测定的方法，具体为：将植物叶片在pH＝7.0的研磨液中冰浴研磨得到匀浆液；然后加入等体积的提取液A，提取液A为丙酮和正己烷按照体积比1：1混合，涡旋混匀后得到混合液，将混合液离心，吸取上清液，然后加入等体积的三氯甲烷溶液，再次涡旋混匀后得到混合液，将混合液离心，吸取上层水相溶液，采用比色法测定上层水相溶液中的H₂S含量。本发明能有效地去除植物叶片总叶绿素对H₂S含量测定的干扰，采用比色法测定植物叶片中H₂S的含量，测定结果准确、可靠，操作简便、实用、快速、可操作性强，解决了现有技术中存在的问题。

技术领域

本发明属于生物测定技术领域，涉及一种去除植物叶片中总叶绿素干扰H₂S含量测定的方法。

背景技术

植物体内低浓度的H₂S是一种信号分子，参与调控植物气孔运动、增强光合作用、延缓衰老、促进植物的生长发育、缓解非生物胁迫等多种生理过程，而高浓度的H₂S对植物细胞有毒害作用。植物内源H₂S主要由半胱氨酸脱巯基酶催化半胱氨酸分解，以及亚硝酸盐还原酶催化的亚硝酸盐还原过程产生。植物在重金属胁迫、高温胁迫、盐胁迫下形成氧化胁迫，造成活性氧的累积，H₂S通过调动抗氧化酶清除活性氧。同时，H₂S 是半胱氨酸合成的底物，在植物应对非生物胁迫中起着至关重要的作用。谷胱甘肽是以半胱氨酸为前体物合成的，参与活性氧的清除，同时也可以合成植物络合素而参与重金属解毒。

5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)比色法(以下简称DTNB比色法)是最常用于测定植物组织(根系或者胚芽鞘)中H₂S含量的一种方法。DTNB比色法通常用100mM的磷酸钾缓冲液(pH＝7.0，其中含10mM EDTA)来研磨植物的组织。磷酸钾缓冲液研磨植物根系后，研磨液呈显根系原色；加入5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)溶液后，其与根系中的H₂S反应生成黄色的硫硝基苯甲酸。由于叶片中叶绿素的存在，如果用该磷酸钾缓冲液研磨植物的叶片，研磨液会呈显绿色，加入5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)溶液后仍为绿色，造成吸光值偏大，从而干扰植物叶片中H₂S的含量测定。目前，除亚甲蓝法外，DTNB法是测定植物根系中H₂S含量的最常用方法，没有发现测定植物叶片中H₂S 含量的相关文献。

发明内容

为了去除植物叶片中总叶绿素对H₂S含量测定的干扰，本发明提供一种去除植物叶片中总叶绿素干扰H₂S含量测定的方法，能有效地去除总叶绿素对H₂S测定的干扰，采用比色法测定植物叶片中H₂S的含量，测定结果准确、可靠，操作简便、实用、快速、可操作性强，解决了现有技术中存在的问题。

本发明所采用的技术方案是，一种去除植物叶片中总叶绿素干扰H₂S含量测定的方法，具体按照以下步骤进行：

步骤S1，将植物叶片在pH＝7.0的研磨液中冰浴研磨得到匀浆液；

步骤S2，吸取匀浆液，然后加入等体积的提取液A，涡旋混匀后得到混合液，提取液A为丙酮和正己烷按照体积比1：1混合得到；

步骤S3，将步骤S2得到的混合液在4℃的条件下离心12-15min，离心速度为12000-14000r/min；

步骤S4，吸取上清液，然后加入等体积的提取液B，涡旋混匀后得到混合液，提取液B为三氯甲烷溶液；

步骤S5，将步骤S4得到的混合液在4℃的条件下离心3-4min，离心速度为 10000-12000r/min；