[发明专利]一种表达羧肽酶G2的基因工程菌及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种表达羧肽酶G2的基因工程菌及其制备方法和应用。所述的基因工程菌为大肠杆菌(Escherichia coli)中同时表达SUMO蛋白标签和羧肽酶G2基因的基因工程菌，表达所述SUMO蛋白标签的SMT3基因位于表达所述羧肽酶G2的CPG2基因的上游。利用本发明的基因工程菌进行CPG2的制备，具有表达效率高、表达量大、成本低且易操作等特点，且所表达的重组CPG2蛋白纯度高(可高达99.1％)、活性高(可高达1792U/mg)，具有良好的产业化应用前景。

技术领域

本发明属于生物技术和基因工程技术领域，具体涉及一种表达羧肽酶G2的基因工程菌及其制备方法和应用。

背景技术

羧肽酶G2(carboxypeptidase G2,CPG2)是一种从假单胞菌属分离获得的锌离子依赖型金属酶，具有水解叶酸及其类似物的C端谷氨酸残基的作用。目前，CPG2被开发作为在使用高剂量的甲氨蝶呤(MTX)产生毒性后的急救措施。CPG2能够将MTX快速水解成两种没有毒性的代谢物：谷氨酸和2，4-二氨基-N[10]-甲基蝶呤(DAMPA)，并且通过肝脏代谢，从而起到清除血清中MTX的作用。假单胞菌属菌株RS-16的CPG2基因最初被克隆到大肠杆菌后，其表达水平相对于菌株RS-16降低了100倍。根据Jeyaharan D等人对CPG2结构进行研究后，通过大肠杆菌表达系统最终获得了250mg/L具有活性的目的蛋白。CPG2共有415个氨基酸，包括C端的25个信号肽序列和390个成熟蛋白氨基酸序列，分子量为84kD。CPG2为二聚体形式，并且每条单体络合4个Zn²⁺才具有生物活性。由于CPG2没有二硫键和糖基化，所以原核表达系统是其进行大量表达的最佳选择。

MTX是一种具有抑制二氢叶酸还原酶活性的叶酸类似物，其抑制二氢叶酸还原酶将二氢叶酸还原为四氢叶酸，从而抑制DNA的合成、修复和复制，最终也使蛋白质合成发生障碍。同时，MTX具有高度的细胞周期依赖性，主要在DNA合成(S期)期间起作用。MTX有皮下注射和口服两种给药途径，是目前应用最广泛的抗癌药物之一，并且高剂量MTX是治疗多种儿童和成人癌症的重要组成部分。同时，MTX也用于自身免疫性疾病的治疗。自1953年首次临床试验以来，MTX的使用剂量急剧增加。MTX一个较大的缺点是它对健康细胞的毒性具有剂量和时间的依赖性。MTX主要由肾排泄清除，但是MTX所致的肾功能不全将导致MTX消除延迟。Brigitte等人在2006年发现MTX一旦被多聚在一起，就会在细胞中长期保留。随着MTX剂量增加，人体中无法快速有效的将MTX全部代谢，从而使MTX在体内的累积，最终导致肝肾损坏、衰竭、中毒性脑病，甚至危及生命等。

目前，对于大剂量使用MTX后中毒的急救措施主要包括充分水化、碱化尿液、血液透析和大剂量使用亚叶酸钙等方法。亚叶酸钙和大剂量MTX的联合使用，在一定程度上能够使DNA和蛋白质的合成恢复成正常水平，但是当MTX浓度升高，亚叶酸钙也很难保护骨髓细胞不受到损坏。水化和碱化尿液同样对于降低MTX血药浓度的效果较差，时间较长。对于血液透析来说，清除速率与分子量成反比。由于MTX分子量大，水溶性差，组织高分布等特点，使得血液透析很难达到预期的清除效果，无法完全清除血液中的MTX。而对于CPG2来说，给药后几分钟内能够将血浆中的MTX浓度降低98％以上，从而降低MTX毒性威胁生命的风险。

CPG2还可应用于抗体导向酶前体药物疗法(ADEPT)和基因导向酶前体药物疗法(GDEPT)。ADEPT是一种两步治疗癌症的方法，其目的是在肿瘤部位选择性地产生一种强效的细胞毒分子。第一步，肿瘤选择性抗体与酶通过化学共轭结合；第二步，通过肿瘤选择性抗体与肿瘤部位结合，释放前药后在肿瘤部位将无活性的前药转化为活性药物，起到杀伤肿瘤细胞的作用。因此，该策略对癌细胞具有较强的细胞毒性作用，而对其他细胞的毒性较小。CPG2是ADEPT疗法目前应用最广泛的酶。GDEPT疗法与ADEPT疗法类似，也是通过两步法达到治疗效果，第一步，将外源性酶的基因转运至肿瘤细胞；第二步，系统给予无毒性的前体药物，通过酶代谢为细胞毒药物。