[发明专利]检测抗菌粉体材料诱发活性氧在细胞内富集水平的方法

说明书

本发明公开了一种检测抗菌粉体材料诱发活性氧在细胞内富集水平的方法，该方法利用荧光探针DCFH‑DA作为活性氧的高灵敏检测分析物，通过得到的DCF荧光信号值可以准确分析菌体内由抗菌粉体材料诱发产生活性氧的含量；该方法结合生物与化学的检测方法，克服电子自旋共振法，化学发光法等技术的局限，为研究活性氧杀菌的抗菌机理打下了坚实的基础。

技术领域

本发明涉及一种检测抗菌粉体材料诱发活性氧在细胞内富集水平的方法，属于生物活性细菌检测与化学活性氧检测相结合的技术领域。

背景技术

根据目前已有的研究成果，无机抗菌材料的抗菌机理主要分为以下三类：接触抗菌、溶出扩散抗菌、光催化抗菌。其中，接触抗菌是认为无机材料直接接触细菌菌体，导致细胞壁细胞膜出现破损或变异，从而破坏了保护功能或传输功能，致使细胞生长受阻或死亡；溶出扩散抗菌机理主要针对离子型抗菌材料，从材料中溶出的金属离子（如Ag⁺、Cu²⁺、Zn²⁺）将扩散至细胞表面或体内，破坏了细胞正常的新陈代谢以及遗传复制，抑制了细菌的生长繁殖；而光催化抗菌则是认为抗菌材料在光照条件下催化产生活性氧，具有较强氧化能力的活性氧会渗透到细胞体内，破坏细胞内重要的生物高分子，导致细胞的失活直至死亡；但是细菌死亡的原因非常复杂，现有的实验往往不能证明抗菌材料属于哪一个单一的抗菌机理，所以设计针对细胞体内的表征手段就显得非常必要。

活性氧（ROS）是指机体内或者自然环境中含氧并且性质活泼的物质的总称。ROS对生物体十分重要，但过量的ROS会对生物体产生氧化损伤导致细胞死亡，因此ROS的存在也成为抗菌领域研究抗菌机理的方向之一。抗菌材料在一定条件下产生的ROS能穿透细菌细胞的细胞壁和细胞膜，进入菌体破坏细胞内重要生物高分子，从而有效杀灭细菌、藻类和微生物等。但由于ROS寿命短、反应活性高，很难被捕获，因此通过活体间接检测材料产生的ROS对于解释生命机体的各种生理反应有着重要的意义，这也有效地将化学领域与生物领域相结合。

已报道过通过化学法直接进行ROS检测的方法有电子自旋共振法（ESR法）、电极测定法、化学发光法。但这些技术存在实验过程复杂，检测工作量大，所需设备昂贵，受限因素多等问题，并且化学法只能检测ROS是否存在，无法证明ROS是否进入机体内部从而起到杀菌目的，这使得在研究光催化产生ROS杀菌机理方面受限。

发明内容

针对现有技术的缺点，本发明提供了一种检测抗菌粉体材料诱发活性氧在细胞内富集水平的方法。

上述方法步骤如下：

（1）将细菌菌株接种至液体培养基中，培养至对数生长期形成细菌悬液，细菌悬液的OD₆₀₀值为1；

（2）将细菌悬液用液体培养基进行稀释，稀释至CFU为5-6×10⁸个/mL；

（3）在5-10mL的稀释菌液中加入100-300μL浓度1×10^-5-3×10^-5mol/L的DCFH-DA 荧光染料液，混匀；该步骤混合液留存一份作为对照样；

（4）然后在混合液中加入0.01g-0.1g抗菌粉体，在37℃下振荡混合20-30min，离心收集沉淀，用pH7.2-7.4的PBS 缓冲液清洗2-3次后，离心沉淀再用PBS 缓冲液制成细菌悬液；

（5）用荧光分光光度计检测步骤（4）细菌悬液和对照样的DCF 荧光信号值，所测得的荧光强度值与活性氧水平成正比；由于对照样品没有活性氧存在，通过与对照样品的荧光强度值比较，判断活性氧进入细胞体内的富集水平。

所述细菌菌株为大肠杆菌BL21。

所述离心转速为8000-8500 r/min。

所述DCFH-DA 荧光染料的激发波长为490±5nm，发射波长为505±5nm。