[发明专利]基于数字PCR技术检测EGFR基因L858R突变的特异性引物、探针及试剂盒

说明书

本发明提供了一种基于数字PCR技术检测EGFR基因L858R突变的特异性引物、探针及试剂盒，所述的基于数字PCR技术检测EGFR基因L858R突变的特异性引物包括上游引物和下游引物，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1～4所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.5～7所示。本发明的EGFR基因L858R突变的特异性引物具有很好的扩增特异性、扩增效率，同时，本发明提供的基于数字PCR技术检测EGFR基因L858R突变的试剂盒，能够对L858R突变频率进行绝对定量、具有高度特异性和较高检测灵敏度；其不仅适用于对病理组织或切片来源的DNA进行检测，同样适用于对血液游离DNA中EGFR基因L858R突变的检测。

技术领域

本发明涉及分子生物学检测技术领域，特别涉及一种基于数字PCR技术检测EGFR基因L858R突变的特异性引物。同时，本发明还涉及基于数字PCR技术检测EGFR基因L858R突变的探针及试剂盒。

背景技术

肺癌是世界范围内常见的恶性肿瘤之一，其发病率仍在逐年上升，已成为恶性肿瘤中致死率最高的癌症。其中非小细胞肺癌(Non Small Cell Lung Cancer，NSCLC)占肺癌总数的80％以上，且因其癌细胞生长分裂较缓慢、扩散转移相对较晚，确诊为非小细胞肺癌患者中70％左右均为晚期，难以通过手术、放疗等手段达到有效治疗。随着肿瘤的个体化治疗基因检测已在临床广泛应用，通过肿瘤个体化用药的靶点基因检测，及时发现用药及耐药位点，进而指导治疗策略，对于个体化治疗及预后分析具有重要的意义。

表皮生长因子受体(Epidermal Growth Factor Receptor，EGFR)是原癌基因c-erbB1的表达产物，是表皮生长因子受体(HER)家族成员之一。大量研究表明，EGFR基因是非小细胞肺癌患者治疗的重要靶点。EGFR具有酪氨酸激酶区活性，其在传递胞外信号、调节细胞增殖及分化中起着至关重要的作用。EGFR基因突变主要发生在第19～21号外显子，其中第21号外显子的点突变主要是第858位密码子出现T-G转换，使该位点的亮氨酸转变为精氨酸，简称为L858R。该L858R突变占EGFR突变的40％～45％，是主要的药物敏感检测位点。

目前，临床常见的基因突变检测方法为扩增阻滞突变系统法ARMS-PCR(Amplification Refractory Mutation System，Polymerase Chain Reaction)，该方法可选择性扩增突变序列，并同时检测一段外控序列进行相对定量，并需要人工对检测结果进行定性判读。且该方法检测样本为病理组织或切片，可检测肿瘤细胞中突变比例为1％的突变基因，因此对组织切片的肿瘤细胞含量要求严格。近年来的研究表明，血浆游离DNA(cfDNA)可作为监控肿瘤负荷的指标并可进行靶点检测，且外周血样本的采集具有操作简单、无创等优势。但是，对于部分患者来说，血液中循环肿瘤DNA(ctDNA)占血液游离DNA(cfDNA)的比例仅为0.01％，限制了外周血样本在肿瘤分子检测时的应用，因此需要开发灵敏度非常高的检测方法以应用于该基因突变检测。

发明内容

有鉴于此，本发明旨在提出一种基于数字PCR技术检测EGFR基因L858R突变的特异性引物，以提高目的基因的扩增效率和扩增特异性。

为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：

一种基于数字PCR技术检测EGFR基因L858R突变的特异性引物，包括上游引物和下游引物，

所述上游引物，选自以下核苷酸序列的一种：

5′-ACT ACTTGGAGGA CCGTCGCTT-3′，

5′-ACTTGGAGGA CCGTCGCTTG-3′，

5′-CCAGGAACGTA CTGGTGAAAA C-3′或

5′-CAGGAACGTA CTGGTGAAAA CA-3′；