[发明专利]基于数字PCR技术检测EGFR基因L858R突变的特异性引物、探针及试剂盒

权利要求书

1.一种基于数字PCR技术检测EGFR基因L858R突变的特异性引物，包括上游引物和下游引物，其特征在于：

所述上游引物，选自以下核苷酸序列的一种：

5′-ACT ACTTGGAGGA CCGTCGCTT-3′，

5′-ACTTGGAGGA CCGTCGCTTG-3′，

5′-CCAGGAACGTA CTGGTGAAAA C-3′或

5′-CAGGAACGTA CTGGTGAAAA CA-3′；

所述下游引物，选自以下核苷酸序列的一种：

5′-ATGGTATTCTTTCTCTTCCGCAC-3′，

5′-CTTTCTCTTCCGCACCCAGC-3′或

5′-GTATTCTTTCTCTTCCGCACCC-3′。

2.一种基于数字PCR技术检测EGFR基因L858R突变的探针，用于与权利要求1中所述的特异性引物配合使用，其特征在于：包括突变型探针和野生型探针；

所述突变型探针的核苷酸序列为5′-FAM-TTGGGCGGGCCAA ACT-MGB-NFQ-3′；所述突变型探针5′端设有荧光基团FAM，所述突变型探针3′端设有淬灭基团NFQ；

所述野生型探针的核苷酸序列为5′-VIC-TTGGGCTGGCCAA ACT-MGB-NFQ-3′；所述野生型探针5′端设有荧光基团VIC，所述野生型探针3′端设有淬灭基团NFQ。

3.根据权利要求2所述的探针，其特征在于：所述突变型探针和所述野生型探针均加入MGB。

4.一种基于数字PCR技术检测EGFR基因L858R突变的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括权利要求1所述的特异性引物和权利要求2-3中任一项所述的探针。

5.根据权利要求4所述的的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括PCR预混液，所述预混液包括dNTPs、Taq酶和PCR缓冲液。

6.根据权利要求4或5中任一项所述的的试剂盒，其特征在于：所述上游引物于PCR反应扩增体系中的终浓度为400～500nM，所述下游引物于所述PCR反应扩增体系中的终浓度为400～500nM，所述突变型探针于所述PCR反应扩增体系中的终浓度为200～300nM，所述野生型探针于所述PCR反应扩增体系中的终浓度为200～300nM。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：所述PCR反应扩增体系的扩增条件为：

a、95℃10min，进行1个循环；

b、94℃30s，58℃1min，进行40个循环；

c、98℃10min，进行1个循环；

d、4℃维持。

8.根据权利要求4或5所述的试剂盒，其特征在于：所述DNA模板的来源为病理组织中提取的DNA、病理切片中提取的DNA或血浆游离DNA。