[发明专利]一种培育高结瘤/固氮转基因植物的方法

说明书

本发明公开了一种培育高结瘤/固氮转基因植物的方法，利用人工miRNAi载体特异性下调表达大豆的GmBTSa基因（基因号：Glyma.05G237500），培育出具有高结瘤/固氮能力的转基因植物。利用本发明构建的下调表达载体转化受体大豆植株获得转基因植物，能够显著提高大豆的结瘤/固氮能力，对提高大豆产量具有重大的意义。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，特别是涉及一种下调特异基因表达的生物工程技术及应用。

背景技术

大豆是重要的粮油经济作物，其通过根瘤可将空气中的氮气转化为可被植物吸收利用的氨态氮，从而为大豆生长发育提供了必需的氮素营养。由根瘤介导的共生固氮过程不仅影响着大豆的正常生长和产量，还有利于节约能源，减少环境污染。目前，提高共生固氮效率已成为提高大豆产量及保证农业可持续发展的重要途径之一。

在分子水平解析调控大豆根系结瘤及共生固氮发挥的机制为在生产上更合理高效地利用并发挥共生固氮过程的效能奠定了重要基础。尽管此前在大豆中克隆并证明了miR172c-NNC1、miR167c-GmARF8、miR393-GmTIR1/AFB2等模块参与调控大豆的根系结瘤及共生固氮（Wang et al., 2014, 2015; Cai et al., 2017），但仍然需要大力挖掘与大豆共生固氮有关的更多的元件或功能基因，从而可为在生产上更为充分地利用该“绿色”氮素营养供给方式提供数据支持。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种基于人工miRNAi 技术下调特异基因表达从而培育高结瘤/固氮转基因植物的方法。

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案如下。

一种培育高结瘤/固氮转基因植物的方法，利用人工miRNAi 载体特异性下调表达植物的 Glyma.05G237500基因或其同源基因，培育具有高结瘤/固氮能力的转基因植物。

作为本发明的一种优选技术方案，该方法包含如下步骤：

A、根据目的基因的序列并考虑miRNA的特异性及其载体，设计如下4条引物用作人工miRNA茎环前体的离体PCR合成：

BTSa I miR-s gaTTTGTCGGACATATGCGTCATtctctcttttgtattcc SEQ ID NO：1；

BTSa II miR-a gaATGACGCATATGTCCGACAAAtcaaagagaatcaatga SEQ ID NO：2；

BTSa III miR*s gaATAACGCATATGTGCGACAATtcacaggtcgtgatatg SEQ ID NO：3；

BTSa IV miR*a gaATTGTCGCACATATGCGTTATtctacatatatattcct SEQ ID NO：4；

进一步设计PEGAD-PA和PEGAD-PB用来扩增最终序列：

PEGAD-PA: GCAGCGGCCGAATTCCCCGGGctgcaaggcgattaagttgggtaac SEQ ID NO：5

PEGAD-PB:GTTATCTAGATCCGGTGGATCCgcggataacaatttcacacaggaaacag SEQ IDNO：6

PEGAD-PA和PEGAD-PB带有载体PEGAD的重组接头，分别含有SmaI和BamHI酶切位点；

B、通过搭桥PCR的方法，将骨架上pre-miRNA的miRNA和miRNA*置换为设计好的序列；以pRS300质粒为模板，分别用引物A和IV，III和II，I和B进行PCR反应，再以三次PCR的产物混合液为模板，用引物PEGAD-PA和PEGAD-PB进行扩增得到修改后的miRNA序列；