[发明专利]一种培育高结瘤/固氮转基因植物的方法

权利要求书

1.一种培育高结瘤/固氮转基因植物的方法，其特征在于：利用人工miRNAi 载体特异性下调表达植物的 Glyma.05G237500基因，培育具有高结瘤/固氮能力的转基因植物；所述植物为大豆。

2.根据权利要求1所述的一种培育高结瘤/固氮转基因植物的方法，其特征在于：该方法包含如下步骤：

A、根据目的基因的序列并考虑miRNA的特异性及其载体，设计如下4条引物用作人工miRNA茎环前体的离体PCR合成：

BTSa I miR-s gaTTTGTCGGACATATGCGTCATtctctcttttgtattcc SEQ ID NO：1；

BTSa II miR-a gaATGACGCATATGTCCGACAAAtcaaagagaatcaatga SEQ ID NO：2；

BTSa III miR*s gaATAACGCATATGTGCGACAATtcacaggtcgtgatatg SEQ ID NO：3；

BTSa IV miR*a gaATTGTCGCACATATGCGTTATtctacatatatattcct SEQ ID NO：4；

进一步设计PEGAD-PA和PEGAD-PB用来扩增最终序列：

PEGAD-PA: GCAGCGGCCGAATTCCCCGGGctgcaaggcgattaagttgggtaac SEQ ID NO：5

PEGAD-PB:GTTATCTAGATCCGGTGGATCCgcggataacaatttcacacaggaaacag SEQ ID NO：6

PEGAD-PA和PEGAD-PB带有载体PEGAD的重组接头，分别含有SmaI和BamHI酶切位点；

B、通过搭桥PCR的方法，将骨架上pre-miRNA的miRNA和miRNA*置换为设计好的序列；以pRS300质粒为模板，分别用引物A和IV，III和II，I和B进行PCR反应，再以三次PCR的产物混合液为模板，用引物PEGAD-PA和PEGAD-PB进行扩增得到修改后的miRNA序列；

反应	上游引物	下游引物	模板
a	A	IV	pRS300
b	III	II	pRS300
c	I	B	pRS300
d	A	B	a+b+c

其中，反应a，b，c扩增程序为：98 ℃ 5 min；98 ℃ 30 sec，56 ℃ 30 sec，68 ℃ 15sec，25个循环；72 ℃ 10 min；反应d扩增程序为：98 ℃ 5 min；98 ℃ 30 sec，56 ℃ 30sec，68 ℃ 30 sec，25个循环；72 ℃ 10 min；

C、通过同源重组的方法将反应d的回收产物连接到PEGAD载体上；用SmaI和BamHI限制性内切酶酶切PEGAD载体获得线性化的载体，用同源重组酶将人工miRNA序列重组到PEGAD载体上；然后将重组产物热激转化到大肠杆菌DH5α感受态中，37℃过夜培养，挑取阳性克隆进行测序，得到重组质粒人工miRNA-PEGAD；

D、通过农杆菌K599介导的毛状根转化法转化目的植物，筛选得到与正常植物相比具有高结瘤/固氮能力的转基因植物。

3.根据权利要求1所述的一种培育高结瘤/固氮转基因植物的方法，其特征在于：步骤D包含如下步骤：

D-1、采用液氮冻溶法转化农杆菌，具体操作为：a. 取出冻存的200 μl感受态细胞，融化后加入5-10 μl质粒DNA，轻弹管壁混匀，冰上放20-30 min；b. 放入液氮中5 min后取出，将管转入37 ℃ 5 min 融化后，加入800 μl LB 无抗性液体培养基，28 ℃低速振荡 150r/min 4-5 h；c. 4000 r/min，30 sec, 去上清，加100 μl LB 液体培养基，悬浮菌体后涂板，含50 mg/ml 卡那霉素；d. 置28 ℃培养至白色转化子长出，用于毛状根的转化；

D-2、农杆菌K599介导的毛状根转化：取目的植物种子材料用氯气消毒10 h后，在B₅培养基上萌发5天，待子叶刚要张开时切下子叶，在子叶下端十字交叉切割，浸在活化的农杆菌K599中侵染30 min后，将外植体转至1/2 MS培养基，0.5×MURA SHIGE SKOOG BASALMEDIOM w/VITAMINS 上共培生长3天后，移栽入蛭石中，暗培3天后光照培养，移栽10天后接种根瘤菌USDA11030 mL/株，培养14天后统计根瘤数量，筛选转基因植物。