[发明专利]一种源于知母的β-葡萄糖苷酶、其编码基因、表达载体及其应用

说明书

本发明公开了一种能够特异催化呋甾皂苷转化为螺甾皂苷的蛋白，AaF26G1，为β‑葡萄糖苷酶的一种。通过设计特定的引物，可从中药知母植物中克隆得到该蛋白的编码基因；利用生物工程的方法，可进一步制备得到含有该蛋白表达基因的表达载体、重组细胞系。通过将上述重组细胞进行扩大培养及诱导表达，可裂解得到该蛋白的粗酶，进一步纯化可得到精酶，所得到的酶可在体外将具有一定结构特征的呋甾皂苷转化为螺甾皂苷。本发明提供的方法能在体外高效转化呋甾皂苷为螺甾皂苷，相比传统的转化方法可控性更好，效率更高，对制备改善老年痴呆症状、抗衰老、抗抑郁、抗肿瘤等多种含螺甾皂苷的药物具有重要的应用价值。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种蛋白，具体涉及一种能够转化呋甾皂苷为螺甾皂苷的β-葡萄糖苷酶。

背景技术

甾体皂苷(Steroidal saponins)是一类重要的中药活性成分，是合成甾体激素及其有关药物的重要原料。在植物中有着广泛的分布，主要存在于百合科、薯蓣科、菝葜科、玄参科、龙舌兰科等植物中，迄今发现此类化合物已达万种以上。甾体皂苷具有抗癌、治疗心血管疾病、调节免疫等多方面的生理活性。至今为止，全球生产的甾体药物高达400多种，其包括甾体激素类、甾体生物碱、强心苷类、甾体皂苷类等。近年来，随着甾体生物转化技术的不断发展，甾体药物被广泛应用于治疗风湿、心血管、胶原性疾病、淋巴性白血病、人体器官移植、抗肿瘤、细菌性脑炎、皮肤病、内分泌失调等疾病。据统计，2011年甾体激素药物销售额就已高于280亿美元，约占全球医药总销售额的6％，成为产量第二大类药物，仅次于抗生素。

螺甾皂苷具有较好的药效活性。甾体皂苷依据F环的环合状态分为呋甾皂苷(Furostanol saponin)和螺甾皂苷(Spirostanol saponin)两种类型。螺甾皂苷甾体皂苷元的结构特征之一就在于E/F的螺环，此螺环半开环可以得到呋甾烷型化合物，全开环则可以得到胆甾烷型化合物。螺甾烷醇苷类具有典型的皂苷性质，如抗真菌、溶血活性，被认为是许多中药的有效成分，一直受到国内外科研工作者的普遍重视；而呋甾皂苷类活性较弱，俄国学者曾进行了甾体皂苷类化合物降胆固醇作用的筛选工作，发现螺甾皂苷类的活性远远高于呋甾皂苷类的活性，后者几乎无降胆固醇作用。螺甾烷型甾体皂苷元是天然产物中一类非常重要的生物活性物质，比如薯蓣皂苷元，具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化、抗高血脂、抗病毒等作用；知母皂苷及其苷元在改善老年痴呆症状、抗衰老、抗抑郁、抗肿瘤等方面有着显著作用。

F26G(Furostanol glycoside 26-O-β-glucosidase)存在于植物体内，为一种β-葡萄糖苷酶，由于它能特异的切开呋甾烷型皂苷C26位的葡萄糖，所以称这个酶为F26G。植物的根茎通常贮存呋甾皂苷，当植物受到损伤或者虫咬时，会释放F26G，生成活性更高的螺甾皂苷，螺甾皂苷的抗虫活性强于呋甾皂苷。因此，呋甾皂苷和螺甾皂苷之间的转化反应是由F26G所催化的，该酶一直被认为是甾体皂苷生物合成途径中的一个关键酶，该酶不同于普通的β-葡萄糖苷酶，有很强的专一性。目前从植物中克隆的F26G基因较少，仅从甘薯和闭鞘姜植物中克隆了F26G。

知母(Anemarrhena asphodeloides Bge.)是重要的常用中药，甾体皂苷在知母根茎中的总含量非常高，约为6％，近50多种不同的呋甾皂苷和螺甾皂苷。近年来，发现知母甾体皂苷具有治疗老年痴呆的作用，知母皂苷BⅡ作为国家I类新药研发。目前虽然存在酶转化法，主要从猪肝脏、微生物中分离纯化出关键的糖苷酶，或者利用基因重组技术获得高活性的重组酶。知母皂苷BⅡ是呋甾皂苷，在知母根茎中含量最高。因此，从知母原植物中克隆合适F26G，将呋甾皂苷转化为活性更强的螺甾皂苷，具有重要的应用价值。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的是，提供一种可在体外将呋甾皂苷转化为螺甾皂苷的蛋白。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

一种蛋白，为β-葡萄糖苷酶的一种，命名为AaF26G1，源于中药知母(Anemarrhenaasphodeloides Bge.)，能够将呋甾皂苷转化为螺甾皂苷。