[发明专利]一种适用于细胞系和动物组织ATAC-seq测序技术的文库构建方法

说明书

本发明涉及一种适用于细胞系和动物组织ATAC‑seq测序技术的文库构建方法，所述方法包括：1)收集细胞或动物组织，制备细胞悬液；2)加入含NP40的裂解液，裂解细胞膜，获得细胞核并纯化；3)收集细胞核进行定量和细胞核完整性检测；4)完整细胞核中加入Tn5转座酶进行转座反应并纯化；5)PCR扩增，构建二代文库并纯化；6)进行高通量测序，得到基因数据。该方法基于转座酶对DNA含量敏感的特征，直接通过DNA含量进行定量操作，适用性广，尤其适用于物种或组织稀少、保存状态较差组织进行文库构建。同时，本发明通过前期的优化使得回收到的细胞核可以用于国产vazyme公司开发的Tn5转座酶并得到了良好的实验结果，使得ATAC‑seq不再受转座酶种类的限制。

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，更具体地，涉及一种适用于细胞系和动物组织ATAC-seq测序技术的文库构建方法。

背景技术

核小体是真核细胞染色质的基本结构单位，由DNA和组蛋白构成。每个核小体由146bp的DNA缠绕在八聚体的组蛋白上形成，两个核小体之间通过一段连接DNA相连，DNA与组蛋白的结合可以发生动态变化。缠绕在组蛋白上的DNA不易与其它蛋白结合，这些DNA通常处于表达抑制状态。没有核小体结合的开放的DNA区域易于与调控蛋白相结合，则可以使其下游的基因处于活跃表达的状态。细胞通过改变DNA与组蛋白的结合位置，从而调控基因的表达。因此，获得处于开放状态的DNA序列可用于研究基因表达的调控机制，是表观遗传学研究的热点，而ATAC-seq则是用于这类研究的最佳利器。

ATAC-seq技术是一种表观遗传学研究技术，通过转座酶对某种特定时空下开放的核染色质区域进行切割，获得在该时空下基因组中所有活跃转录的调控序列。然而，现有技术中绝大多数ATAC-seq实验都是首先通过流式细胞分选技术(FACS)收集50,000个活细胞或者使用流式细胞核分选(FANS)筛选50,000个细胞核进行实验，此项技术所需的工作量较大，成本太高，受众很窄，不适用于普通实验室大量进行ATAC-seq实验。

再次，针对起始量的问题，几乎所有ATAC-seq实验要求的起始量都是50,000个细胞，但是不同生物50,000个细胞所含的DNA数量完全不一样，视该生物的基因组大小而定，且所有的参考文献都是使用DAPI对细胞核进行染色，使用荧光显微镜进行计数。首先荧光显微镜价格很高，很多实验室没有该仪器，再就是DAPI为致癌的试剂，另外使用显微镜计数需要很高的人力，不适合进行大通量的操作。

发明内容

针对现有技术中存在的技术问题，本发明提出了一种适用于植物组织ATAC-seq测序技术的文库构建方法，该方法操作简单，适用性广，尤其适用于物种或组织稀少、保存状态较差组织进行文库构建。

为实现上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：

一种适用于细胞系和动物组织ATAC-seq测序技术的文库构建方法，所述方法包括以下步骤：

(1)收集细胞或动物组织，制备细胞悬液；

(2)加入含NP40的裂解液，裂解细胞膜，获得细胞核并纯化；

(3)收集细胞核进行定量和细胞核完整性检测；

(4)完整细胞核中加入Tn5转座酶进行转座反应并纯化；

(5)PCR扩增，构建二代文库并纯化；

(6)进行高通量测序，得到基因数据。

进一步地，所述细胞悬液制备方法为：对于细胞系，收集含有10⁵个细胞的细胞沉淀；对于组织样，取0.05g组织进行液氮研磨，将所述沉淀用预冷的RSB混合液重悬；所述RSB混合液包括10mM Tris-HCl、10mM NaCl、3mM MgCl₂。