[发明专利]用于高浓度淀粉液化的a-淀粉酶突变体及其编码基因和它们的应用

说明书

本发明属于酶工程和基因工程领域，公开了用于高浓度淀粉液化的a‑淀粉酶突变体及其编码基因和它们的应用。所述a‑淀粉酶突变体具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列；或具有在SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的基础上经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且酶活性不变的由SEQ ID NO：2衍生的氨基酸序列。本发明的人工合成a‑淀粉酶突变体可在pH4.5‑6.0、温度60‑110℃和无钙离子液化体系下，对高浓度淀粉乳初始浓度进行高效稳定的水解，达到高浓度淀粉液化工艺迅速降粘的要求。同时，减少钙离子的添加更有利于实现产品的下游加工应用。

技术领域

本发明属于酶工程和基因工程领域，具体地，涉及一种用于高浓度淀粉液化的a-淀粉酶突变体及其编码基因和它们在高浓度淀粉液化中的应用。

背景技术

淀粉是自然界中储量最为丰富的碳水化合物之一，也是极其重要的工业原料，然而淀粉需要初步处理之后才可以应用于糖类、氨基酸、酒精发酵等深加工行业中，淀粉初步处理首先将含有淀粉颗粒的乳浊液升温至60-70℃，使得淀粉颗粒吸水膨胀，形成糊状的液体(即糊化)，糊化后的淀粉在淀粉酶的作用下被迅速降粘液化成短链的糊精(即液化)，液化是淀粉水解中一个十分重要步骤，其中a-淀粉酶对淀粉液化效果具有决定性的作用。大规模工业化的淀粉液化工艺主要采用瞬间高温喷射液化，在此过程中，淀粉醪的温度可达105℃以上，这就要求所采用的淀粉酶具有良好的热稳定性，它在作用于淀粉浆溶液时可将淀粉浆溶液的粘稠度迅速降低。目前，工业上大规模生产中淀粉液化采用的a-淀粉酶主要为诺维信和杰能科开发的高温a-淀粉酶，该酶来源于地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)，经过蛋白质工程的改造该酶在95℃时的半衰期已达到达250min，然而该酶的活性和稳定性依赖于钙离子的存在，钙离子的存在会严重抑制以淀粉糖为原料制备高果糖浆中关键酶葡萄糖异构酶的活性。

另一方面，随着淀粉糖生产企业进一步降低生产成本的需求，高浓度液化工艺逐渐推出，淀粉乳初始浓度由原来的25-30重量％逐步提升到35重量％以上，淀粉乳初始浓度升高时，淀粉糊化后粘度的增加使得液化控制变得困难，并且对淀粉酶的特性提出了新的需求，在高浓度液化工艺下a-淀粉酶需要耐高温、最适催化温度范围宽泛、性能稳定和催化效率高等特性以实现快速降粘、提高仪器运转效率、保障淀粉液化质量。而目前国内为实现高浓度液化，基本都是在液化工艺上的进行改进，如CN104520333A中公开了一种连续液化高浓度淀粉的方法，即在采用两阶段液化及多种降解淀粉的酶的复配工艺，该工艺操作步骤多，酶制剂用量繁琐；CN104293863A中公开了一种促进高浓度淀粉液化的预处理方法，采用中温α-淀粉酶复配耐高温α-淀粉酶的方法，但该方法降粘效果有限，而且还增加了酶制剂的成本；CN104911234A提供了与CN104293863A类似的分步液化高浓度玉米淀粉的方法，以40-65重量％的高浓度玉米淀粉乳为反应底物，采用中温α-淀粉酶和耐高温α-淀粉酶复配分步液化，然而酶制剂的用量是CN104293863A方法的6-370倍，才能得到合适糖化的液化液；此外，CN201610726308.3中公开了一种高浓度淀粉连续喷射液化的方法，该方法采用浓度40～50％的淀粉乳，以喷射液化完成后的液化液按照15-35重量％回流至喷射泵进料口，以料代水对喷射瞬间高温后的糊化液进行降粘。而在淀粉酶制剂方面，主要集中在对现在已有的中温淀粉酶和高温淀粉酶的耐高温型和催化活性进行改造，或开发新的耐高温淀粉酶，如专利CN107312763A、CN107312764A、CN107326020A和CN107345223A均是以来源于地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)的a-淀粉酶为模板进行不同位点及少数氨基酸的突变获得a-淀粉酶突变体，该突变体可在80-110℃，pH值5.0-5.8，条件下实行很好的淀粉液化，其实施例采用的干基质量分数为32重量％的淀粉乳对a-淀粉酶突变体进行应用效果评价，同时淀粉乳的最高浓度也只是尝试到了37重量％，未进行高浓度淀粉(>40重量％)液化效果的测试。因此，可见目前还没有针对高浓度淀粉液化这一特定工艺需求开发的专用酶制剂。

发明内容