[发明专利]一种中继式纳米稀土上转换发光材料及中继式蛋白酶活性检测方法

说明书

一种中继式纳米稀土上转换发光材料及中继式蛋白酶活性检测方法，属于蛋白质检测领域。该方法主要通过构建基于可以进行中继式能量转移的纳米稀土上转换发光探针实现，具体的以纳米稀土上转换发光颗粒作为核心，在纳米颗粒表面直接连接的可以吸收上转换纳米探针发射光的中继层染料，以及末端修饰可以与中继层染料形成共振能量转移基团的多肽底物。在近红外激发光照射下，加入能够与多肽底物进行反应的蛋白酶，进行蛋白酶活性的检测。该蛋白酶检测方法检测灵敏高、普适性高，具有一定的临床应用价值。

技术领域

本发明涉及蛋白质检测领域，尤其涉及一种中继式纳米稀土上转换发光材料及中继式蛋白酶活性检测方法。

背景技术

稀土元素，是指镧系(La至Lu)的15种元素以及与镧系元素位于同一IIIB族的钪(Sc)和钇(Y)。而通常所讲的稀土元素，多指镧系元素，由于其具有未充满的4f电子轨道与相应的运行电子，因而产生了丰富的电子能级，所产生的各种电子能级使得该类材料具有丰富的光学特性。与传统有机染料和量子点借助一定数量原子协同作用不同，基于稀土元素的发光材料直接依赖稀土原子本身进行光能转换，因此，不会存在染料分子漂白，量子点闪烁等不利于分析检测的性质。其中纳米稀土上转换发光材料可以通过近红外光源激发的方式降低检测中的自发荧光与散射信号，进一步提高检测灵敏度，因此在生物医学等领域有着重要的应用。

发光共振能量转移是指在两个不同的发光基团中，如果一个基团(供体Donor)的发射光谱与另一个基团(受体Acceptor)的吸收光谱有一定的重叠，当这两个荧光基团间的距离合适时(一般小于10nm)，就可观察到荧光能量由供体向受体转移的现象，是一种非常高效的能量转移方式，在生物分析领域有着广泛的应用。

但是基于纳米稀土上转换发光材料的共振能量转移却存在能量转移效率低的问题，通常纳米稀土发光材料的尺寸往往大于10nm，并且与传统染料和量子点区别在于发光是由纳米颗粒中均匀分布的发射元素实现的，如果在纳米颗粒表面直接修饰按照常规末端修饰能量受体的多肽底物会造成大量的纳米晶内部的发射单元无法和能量受体形成共振，从而无法形成有效的能量转移，从而影响基于纳米稀土发光材料在分析检测中的应用，如图2所示，现有技术中蛋白酶浓度高达10ng/ml时才能检测到染料的荧光强度，随着酶浓度的增加，检测到稀土基纳米晶的荧光强度增加，但18ng/ml的酶作用下，检测到的荧光强度值小于50，其检测灵敏度不高，且现有技术中利用纳米稀土上转换发光材料检测蛋白质活性的方法，还存在操作复杂，用时长的问题。

发明内容

为解决上述问题，本发明通过构建具有中继能量传递层的纳米稀土上转换发光材料蛋白酶检测探针将稀土发光材料所发射能量充分利用，将传统的一次低效能量转移转化为两次高效能量转移，实现靶标蛋白酶的简单、快速、高灵敏检测。

主要是通过对上转换纳米颗粒进行氨基双磷酸小分子配体进行功能化后，紧贴上转换纳米颗粒表面进行中继层染料分子修饰，同时在上转换纳米颗粒末端修饰多肽底物，多肽底物上连接有能够吸收中继层染料分子能量的发光染料。

由于双磷酸小分子配体的短距离可以令中继层染料分子和稀土发光元素距离大大缩短，从而将能量高效转移到中继层染料分子表面，此时利用能与中继层染料分子可以形成共振能量转移基团的多肽底物染料分子，将能量通过作为能量中继站(即中继层染料分子)转移到末端多肽底物的能量受体(即连接在多肽底物上的染料分子)，从而提高材料的能量转移效率。

当目标蛋白酶存在时，多肽底物被蛋白酶特异性识别并剪切，连接有染料的多肽分子便离开纳米探针，中继层分子能量不再被吸收，恢复发光能力，其恢复程度与酶活性呈线性关系，通过荧光检测的方法可以获得相应的信号强度，实现高灵敏度的蛋白酶检测。

具体的本发明提供一种中继式纳米稀土上转换发光材料，包括纳米稀土上转换发光材料UCNP和能吸收纳米稀土上转换发光材料UCNP所发光能量的染料分子，所述染料分子在1-10nm内连接在纳米稀土上转换发光材料UCNP的表面。