[发明专利]一种肠道原生菌基因改造的方法

说明书

本发明提供一种肠道原生菌基因改造的方法。利用合成生物学的方法将筛选出的肠道原生大肠杆菌基因改造后进行微囊化处理。以原生大肠杆菌分泌单一功能性生物活性分子——粘性蛋白(Ag43)为例，研究其在炎症性肠病(IBD)治疗方法的应用。为研究肠道微生物与机体互作提供了一种新思路。将生物安全的合成生物学技术与无创伤式光遗传技术相结合应用于肠道疾病的治疗，相对于传统的肠道疾病治疗的方法而言具有诸多优势：筛选肠道原生大肠杆菌进行基因改造，提高了后期微囊化原生菌肠道定植的生物顺应性。将合成生物学技术与光遗传技术相结合，实现了对治疗肠道疾病的生物活性分子在时空上的精确调控。

技术领域

本发明涉及微生物及临床治疗领域，具体涉及一种肠道原生菌基因改造的方法。

背景技术

肠道作为生物体最大的器官，在消化吸收、免疫调节等方面发挥了重要作用。肠道内除了发挥消化吸收、免疫调节功能的上皮细胞、免疫细胞之外，还包含了许多微生物。其中大于99.9％的微生物都是细菌，它们统称为肠道菌群。

肠道菌群作为生物体肠道的“共生体”，参加了许多重要生命过程及疾病的调控。现有研究肠道微生物与机体关系的方法多为利用无菌小鼠或广泛的菌群移植，结合微生物组学与代谢组学等分析，找到肠道微生物对于疾病的调控并精确到分子或基因靶点。但是无菌小鼠价格高昂，并且由于基因敲除后存在一定的免疫缺陷，不能完全满足研究需要。菌群移植存在移植周期长，定植效率低等问题。

我们从合成生物学的角度出发，筛选出小鼠肠道共生菌E.coli NGF-1，利用“光感启动子+功能分子”模式(pDawn-GFP-Ag43、pDawn-RGF-TGF-β1)，利用光遗传手段调控黏连蛋白及转换生长因子的表达，以实现对肠道菌群的快速、精确的定植，并以转换生长因子为例，探究肠道微生物分泌单一元素对机体的影响。为了更加适合活体使用，加入的上转换微球将组织穿透性强的近红外光转换为肠道内局部的可见光，对肠道菌群的定植，乃至微生物对机体生物功能的研究起到了促进作用。

发明内容

本发明为克服现有技术的不足,提供一种肠道原生菌基因改造的方法。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：一种肠道原生菌基因改造的方法，利用合成生物学的方法将筛选出的肠道原生大肠杆菌基因改造后进行微囊化处理,主要步骤如下：

1)C57BL/6小鼠肠道原生大肠杆菌的筛选；

2)利用合成生物学的手段对原生大肠杆菌进行基因改造

(1)利用合成生物学的手段合成两套质粒系统：pDawn-GFP-Ag43，其中pDawn是蓝光响应启动子，是一段DNA序列。在接收到蓝光信号后，会启动下游基因GFP-TGF-β1的转录；RFP在转录后翻译成绿色荧光蛋白，充当报告基因的功能；Ag43是粘性蛋白，是一种蛋白类的生物活性功能分子；

(2)利用化学诱导-CaCl₂法将筛选出的原生大肠杆菌诱导成感受态；

(3)进行质粒转化，将光控质粒系统转化到原生大肠杆菌感受态内,通过观察荧光标签的表达来证明功能分子Ag43的表达；

3)将改造后的原生菌进行微囊化处理。

所述步骤1)具体步骤为：

(1)取C57BL/6小鼠新鲜肠道组织于无菌EP管中；

(2)用提前预冷的无菌PBS冲洗肠道内容物；

(3)将肠道壁剖开后，用无菌载玻片剐取肠道内壁，将肠道内壁物与无菌预冷PBS质量体积比m/v＝1:10混合后，漩涡震荡15min；

(4)将混合物4℃，2000rpm离心5min，弃去沉淀，将上清于4℃，12000rpm离心20min，弃去上清，留沉淀；