[发明专利]一种肠道原生菌基因改造的方法

权利要求书

1.一种肠道原生菌基因改造的方法，其特征在于：利用合成生物学的方法将筛选出的肠道原生大肠杆菌基因改造后进行微囊化处理,主要步骤如下：

1)C57BL/6小鼠肠道原生大肠杆菌的筛选；

2)利用合成生物学的手段对原生大肠杆菌进行基因改造

(1)利用合成生物学的手段合成质粒系统：pDawn-GFP-Ag43，其中pDawn是蓝光响应启动子，在接收到蓝光信号后，会启动下游基因GFP-Ag43的转录；

(2)利用化学诱导-CaCl₂法将筛选出的原生大肠杆菌诱导成感受态；

(3)进行质粒转化，将光控质粒系统转化到原生大肠杆菌感受态内,通过观察荧光标签的表达来证明功能分子Ag43的表达；

3)将改造后的原生菌进行微囊化处理。

2.根据权利要求1所述的一种肠道原生菌基因改造的方法，其特征在于：所述步骤1)具体步骤为：

(1)取C57BL/6小鼠新鲜肠道组织于无菌EP管中；

(2)用提前预冷的无菌PBS冲洗肠道内容物；

(3)将肠道壁剖开后，用无菌载玻片剐取肠道内壁，将肠道内壁物与无菌预冷PBS质量体积比m/v＝1:10混合后，漩涡震荡15min；

(4)将混合物4℃，2000rpm离心5min，弃去沉淀，将上清于4℃，12000rpm离心20min，弃去上清，留沉淀；

(5)将沉淀用100μL PBS重悬后，取10μL涂布于用于蓝白板筛选的固体LB平板上，37℃，过夜培养；

(6)第二天根据平板的生长情况，挑取蓝色菌落用于菌落PCR(菌落PCR的两对引物分别LaZ-YZ-F:AACGGGGGTACTGACGAAAC；LaZ-YZ-R:GAACCATCCGCTGTGGTACA)，根据菌落PCR的目的条带大小，筛选出C57BL/6小鼠肠道原生大肠杆菌。

3.根据权利要求1所述的一种肠道原生菌基因改造的方法，其特征在于：所述步骤3)具体步骤为：

(1)将海藻酸钠配成质量分数1-10％的溶液后进行灭菌处理，将培养至对数生长中期的原生大肠杆菌加入到经过灭菌处理的海藻酸钠溶液中，进行搅拌处理，作为制备微胶囊的内液；

(2)将二甲基硅油与CaCl₂粉末共混后作为外液；

(3)内液注射泵的流速为10uL/min，外液注射泵的流速为200uL/min。注射泵和对冲式毛细管微液滴芯片之间用PE管连接，即搭建微流控平台，生成的液滴用CaCO₃的醋酸溶液收集，此时生成的原生菌微胶囊粒径为500um。