[发明专利]一种提高N端脑钠肽NT-proBNP稳定性的缓冲体系及制备方法

说明书

本发明提供一种提高心功能标记物N端脑钠肽NT‑proBNP稳定性的缓冲体系及制备方法，所述的NT‑proBNP重组蛋白与SUMO标签蛋白融合表达，并通过SUMO酶酶切去除，纯化获得无标签的NT‑proBNP重组蛋白，具有如SEQ.No.1所示的氨基酸序列，本发明所述的提高NT‑proBNP重组蛋白稳定性的缓冲体系为含有5%‑10%海藻糖，5%‑20%甘油，5%‑15%环糊精，3%‑8%山梨醇，pH为6.5~7.4的PBS缓冲液，可以使NT‑proBNP重组蛋白具有天然的NT‑proBNP蛋白的生物活性，可作为心衰诊断试剂标准品和抗体制备的优质可靠的原料，而且纯度高，成本低，稳定性高，具有较高商业化价值。

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种提高N端脑钠肽NT-proBNP稳定性的缓冲体系及制备方法。

背景技术

利钠肽(NP)家族现在越来越受到重视，大多数人类利钠肽家族是由心脏分泌的，并起到控制水盐平衡、维持压力调节稳态等作用。心血管利钠肽内分泌组分包括ANP、BNP、CNP、DNP和VNP。尽管分型各不相同，但是大多数种类的利钠肽在相同种属间的进化是相当保守的。在种属内存在差异的哺乳动物只有BNP及其氨基末端前体BNP (NT-proBNP)。

B型利钠肽除了具有利钠肽共有的那些功能外，还可能具有抑制肾素-血管紧张素-醛固酮系统、抗心肌纤维化、强松弛性等作用。BNP主要在心脏表达，尤以心房表达更加丰富。另外，BNP的释放受到压力和容量两种因素调节，进而能预示出心室容积扩大、左室舒张末期压增大，心室超负荷以及心脏损伤程度等一系列心血管异常情况。

NT-proBNP是在BNP前体(proBNP)形成BNP过程中产生的一种无生物活性的蛋白，在代谢过程中，产生的BNP与NT-proBNP含量相同，所以NT-proBNP与BNP同样可以作为一种心脏标志物。但是NT-proBNP缺乏主动清除机制，NT-proBNP在体液中的半衰期要长，浓度更大，更容易检测，并且检测样本更容易获得，因此其已经成为一种主要的心脏检测指标。

2002年，FDA批准了罗氏公司研究发现的NT-proBNP上市。随后BNP作为心衰的诊断指标，分别于2005年、2007年写入ESC/AHA心衰防治指南与中国心衰诊疗指南。 NT-proBNP检测在本世纪初先后进入我国，十几年来已经为各级医院和医师广泛用于临床实践，成为心血管病尤其是心力衰竭诊断十分有用的生物标志物。尤其在当下我国老龄化趋势愈加严重、心衰危险因素流行增加造成心力衰竭发病率持续升高的背景下，NT-proBNP 用于心衰高风险人群的筛查对于心衰的及时预防、早期发现及有效管理，从而降低心衰的发病率及死亡率具有重要意义。

由于NT-proBNP目前已经作为生化检验中重要的一种检测指标，因此NT-proBNP标准品目前在临床应用广泛，NT-proBNP标准品的用量非常大，目前常用的表达系统主要有大肠杆菌表达系统、毕氏酵母表达系统、真核细胞表达系统等。然而，真核表达系统投资巨大，表达周期长，生产条件要求高。并且NT-proBNP氨基酸结构简单，并没有复杂的翻译后加工过程，所以选择大肠杆菌表达系统是经济实用，表达产率高，纯化工艺简单的一种生产策略。目前，市面上的NT-proBNP标准品大多是采用大肠杆菌表达系统表达后再纯化的产品。因其需求量大，因此需要能高产量重组表达NT-proBNP的方法。

NT-proBNP标准品的瓶颈在于其稳定性，要做到一级标准品要求NT-proBNP要稳定两年以上，而天然的NT-proBNP具有73个氨基酸，分子量小，易降解，半衰期仅为24小时。随着生物技术在诊断领域的发展，引进了许多新的多肽获得方法。本发明则利用了基因工程的方法表达NT-proBNP，并在前期基因设计综合考虑NT-proBNP的结构特性，得到了重组的NT-proBNP多肽。重组NT-proBNP与天然的NT-proBNP具有相同的氨基酸，并且具有相同的免疫原性。

发明内容