[发明专利]一种提高N端脑钠肽NT-proBNP稳定性的缓冲体系及制备方法

权利要求书

1.一种心功能标记物NT-proBNP重组蛋白，其特征在于，制备步骤如下：

步骤一、设计融合SUMO标签蛋白的NT-proBNP重组蛋白；

步骤二、培养大肠杆菌；

步骤三、诱导表达，使步骤一设计的融合蛋白在大肠杆菌中表达，得到融合SUMO标签蛋白的NT-proBNP重组蛋白；

步骤四、分离纯化步骤三中表达的融合SUMO标签蛋白的NT-proBNP重组蛋白；

步骤五、用SUMO酶对步骤四得到的融合蛋白进行酶切，得到NT-proBNP重组蛋白和SUMO标签蛋白混合蛋白；

步骤六、步骤五得到的混合蛋白进行分离纯化，得到高纯度的NT-proBNP重组蛋白，其氨基酸序列为SEQ.No.1。

2.根据权利要求1所述的心功能标记物NT-proBNP重组蛋白，其特征在于，步骤二中大肠杆菌培养时培养基组成成分质量体积比为甘油1~1.5%、葡萄糖4.5~5%、酵母粉1.8~2.4%、蛋白胨1.2~1.8%、磷酸氢二钾1.8~2.4%和磷酸二氢钾0.20~0.30%。

3.根据权利要求1所述的心功能标记物NT-proBNP重组蛋白，其特征在于，步骤三中大肠杆菌表达时，在诱导表达过程中加入乙醇0.1%-3%和IPTG 0.1-1mM，诱导温度为15℃-25℃，诱导时间为4-20h。

4.根据权利要求1所述的心功能标记物NT-proBNP重组蛋白，其特征在于，步骤四表达的融合SUMO标签蛋白的NT-proBNP重组蛋白，融合后的氨基酸序列为SEQ.No.2。

5.根据权利要求1所述的心功能标记物NT-proBNP重组蛋白，其特征在于，步骤四分离纯化时采用亲和纯化方法Ni-IDA Beads 6FF，用咪唑进行纯化和洗脱，孵育纯化时使用的咪唑浓度含量为20~25mM，洗脱时分别用浓度为45~50mM和450~550mM的咪唑进行，每次2~4h，得到高纯度融合SUMO标签的NT-proBNP蛋白。

6.根据权利要求1所述的心功能标记物NT-proBNP重组蛋白，其特征在于，步骤五SUMO酶酶切时SUMO酶与融合SUMO标签蛋白的NT-proBNP蛋白的质量比为1:200，酶切缓冲液为含有质量比为1-10mMDTT，5%-20%甘油的PBS缓冲液，pH为pH6.5-7.4，酶切温度20-30℃，反应时间2~4h。

7.根据权利要求1所述的心功能标记物NT-proBNP重组蛋白，其特征在于，步骤六纯化时采用亲和纯化方法Ni-IDA Beads 6FF，SUMO标签蛋白和SUMO酶均分别与Ni-IDA Beads6FF结合，而NT-proBNP蛋白与Ni-IDA Beads 6FF不结合，用咪唑进行纯化和洗脱，孵育纯化时的咪唑浓度含量为20~25mM，洗脱时分别用浓度为45~50mM和450~550mM的咪唑进行，每次2~4h，得到高纯度无标签的NT-proBNP的蛋白。

8.一种提高心功能标记物NT-proBNP稳定性的缓冲体系，其特征在于，高纯度NT-proBNP蛋白存储缓冲体系为含有质量比为5%-10%海藻糖，5%-20%甘油，5%-15%环糊精，3%-8%山梨醇的PBS缓冲液，其pH为6.5~7.4。