[发明专利]用于定量监测山核桃干腐病侵染和传播的qLAMP方法及所用引物

说明书

本发明公开了一种用于监测山核桃干腐病病菌孢子数量动态的定量环介导等温扩增引物，q‑LAMP引物组合物由以下4条引物组成：上游外引物(F3)、下游外引物(B3)、上游内引物(FIP)、下游内引物(FIB)。本发明还同时提供了包含上述q‑LAMP引物组合物的定量环介导等温扩增试剂盒，以及提供了利用该试剂盒进行的山核桃干腐病病菌孢子数量动态的定量环介导等温扩增方法，从而获得孢子数量、DNA浓度。采用本发明的方法能定量监测雨水、树体和土壤等处的山核桃干腐病菌孢子数量。

技术领域

本发明属于生物技术与植物病害流行学领域，涉及定量环介导等温扩增(qLAMP)技术用于监测雨水、树体和土壤等处山核桃干腐病病菌孢子数量的定量环介导等温扩增引物组及其使用方法，属于植物病害流行学、动态监测及预警的技术领域。

背景技术

茶藨子葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea)是寄主依赖型弱寄生性植物病原真菌，寄主范围很广，是一种世界范围内危害木本植物健康的真菌病原，其中侵染山核桃树干引起山核桃干腐病。山核桃干腐病在浙西等山核桃主产区普遍发生，受害面积逐步扩大，是山核桃产业发展的瓶颈。病原菌以菌丝体在山核桃树体内越冬，翌年春季潜伏在树体内的病菌开始活动，突破树皮形成溃疡斑，其表面形成子实体并释放孢子，引起新的侵染。孢子借风雨传播，侵入树皮细胞或树体伤口后表现明显的“潜伏侵染”特性，从3月下旬开始到11月都有不同程度的病害发生。4月中旬至6月中旬气温在25℃—30℃是孢子释放侵染的高峰期的高峰，7～8月气温30℃以上的高温天气不利于病菌的发展，秋季气温下降至30℃以下又会产生病菌的发展。目前急需一种快速，准确监测雨水、树体等处山核桃干腐病病菌孢子数量的技术，以达到对干腐病的传播与发生做出科学合理的预测预报的目的。

随着核酸相关的鉴定方法不断发展，基于普通PCR的方法已经成功用于检测山核桃干腐病菌，但PCR法特异性等检测耗时偏长，需要6～8h，且检测灵敏度偏低，检测过程较繁杂，关键的是还容易受到各种PCR抑制物的影响。环介导等温扩增技术(Loop-mediatedisothermal amplification，LAMP)是日本荣研株式会社发明的一种新的核酸扩增技术，因为其扩操作简便、快速、特异性高、成本低等优点，成为可以替代PCR的新的核酸扩增技术。它是针对靶基因的6个区域设计4对特异性引物，在Bst大片段聚合酶的作用下引起自循环链置换反应，60-65℃范围60min内，能大量合成目标DNA。由于LAMP扩增过程依赖识别靶序列6个独立区域，所以反应特异性很强，并且核酸扩增过程是在恒温条件下进行，普通水浴锅或者等温保温瓶就能满足反应要求，检测成本降低，所需时间短。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种用于监测雨水、树体等处山核桃干腐病菌孢子数量的定量环介导等温扩增(q-LAMP)方法、引物组合物和试剂盒。

为了解决上述技术问题，本发明提供用于监测山核桃干腐病病菌孢子数量动态的定量环介导等温扩增引物，q-LAMP引物组合物由以下4条引物组成(即，由上下游外引物，上下游内引物这四条引物组成)：

上游外引物(F3)：5’—TGTCCATAGGTTCACCTCCA—3’；

下游外引物(B3)：5’—AGATGGTCTGCCTGTGGT—3’；

上游内引物(FIP)：5’—CAAAGTCAGCGCGATGCAGCGACCGGCCAATGCGTAAG—3’；

下游内引物(FIB)：5’—AGGGTAACCAAATCGGTGCTGCGTCGATTCGCGTTAGCGG—3’。

本发明还同时提供了用于监测山核桃干腐病病菌孢子数量动态的定量环介导等温扩增试剂盒，包含上述q-LAMP引物组合物。

作为本发明的试剂盒的改进：正/反内向引物FIP/BIP的浓度为1.6μM，正/反向外引物F3/B3的浓度为0.125μM。