[发明专利]一种利用脐带血制备血清替代物的方法

说明书

本发明提供一种利用脐带血制备血清替代物的制备方法，使用脐带血库得到的脐带血，进行全血浓缩，加入凝血酶对血小板进行生理刺激，得到血小板裂解产物。该方法包括：（1）对脐带血全血浓缩，离心，保留下层血细胞层；（2）对血细胞层添加凝血酶，静置；（3）离心，保留上清液。本发明制备的血清替代物含有的血小板释放的因子含量更高；免疫原型低；效果稳定；采用全血直接制备，方法简单快捷。

技术领域

本发明属于细胞生物学技术领域，具体涉及一种混合脐带血血清替代物的制备方法及其应用。

背景技术

间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是来源于发育早期中胚层的具有高度自我更新能力和多向分化潜能的多能干细胞，可在体外培养扩增并能在特定条件下分化成神经细胞、成骨细胞、软骨细胞、肌肉细胞及脂肪细胞等。随着对MSCs生物学特性及功能研究的深入，目前已从多种组织中分离出MSCs。MSCs扩增迅速，免疫原性低，易于转染外源基因，已成为实施细胞治疗的理想细胞。现主要依靠胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)添加至培养基中促进MSCs增殖，FBS来源广泛(主要来自胎牛全血或血清)，且含有各种利于细胞增殖的生长因子及蛋白成分，可满足MSCs的增殖；但FBS属异种蛋白，会导致细胞增殖期发生免疫反应，而且可能含有朊病毒（prion）或其它病毒，易发生朊病毒等牛感染病毒污染的风险，添加FBS培养的MSCs输入人体可能引起过敏反应或传播病毒，其应用于人体治疗时会危及生命，因而给临床应用带来障碍。因此如何保障细胞培养的安全尤为关键。

人源血小板输注到人体内不会引起异种蛋白的免疫，且其能够释放多种细胞生长因子，在组织修复以及细胞生长等方面起着重要作用，因而越来越多的研究者关注人血小板裂解后的产物形成血清替代物用于细胞培养的安全性和有效性。血小板(platelet)是哺乳动物血液中的无核细胞，小于红细胞和白细胞，除了可以在止血的时候提供凝聚作用外，还能通过胞内α颗粒的脱颗粒作用释放大量细胞生长因子。血清替代物是指利用凝血机制被激发后，被激活的血小板进一步裂解后所获得的液体成分，含有多种生物活性因子，包括血小板源性生长因子(PDGF)、转化生长因子-β(TGF-β)、类胰岛素生长因子-1(IGF-1)、成纤维细胞生长因子(FGF)、血管内皮生长因子(VEGF)等，这些生长因子可以刺激成纤维细胞、平滑肌细胞和造骨细胞的增殖，并能吸引多种细胞成分参与损伤组织的修复，还可以诱导MSCs及内皮细胞进行有丝分裂、分化及复制，以及促进组织愈合。富血小板血浆经细胞裂解后进一步提纯，不仅去除了残余细胞结构，降低了免疫原性，而且还保留了多种生长因子，替代FBS培养MSCs，可为异体或异种移植创造条件。

人血清替代物中富含促多种生长因子，是扩增临床应用规模MSCs的最合适的人源化的FBS替代品。目前国内外研究主要将血清替代物用于体外培养各种来源的MSCs；近年来在骨组织工程中的大量实验显示，利用血清替代物在保持了骨髓基质干细胞生长能力和表型的同时，还能促进人骨髓基质干细胞增殖。

很多研究报道采用反复冻融法可以制备人血清替代物，但其制备效果不稳定，不同批次的样本需要的冻融次数不确定，导致血小板裂解不完全，释放因子含量差异性较大，不能最大程度的激活血小板释放出大量的细胞因子。而且实验研究显示，相较于反复冻融法，生理刺激法制备的人血清替代物不但同样可用于细胞培养，而且在促进细胞因子释放方面更有优势，细胞因子得到进一步释放，从而替代FBS用于细胞培养尤其是临床的细胞移植实践。

目前对于人血清替代物的研究主要采用少数志愿者外周血分离浓缩血小板或单采血小板制备，无法大规模制备，满足临床培养MSCs的需求。本研究依附于山东省脐血库丰富的脐带血资源，造血干细胞制备时会有大量废弃的脐带血、脐血浆以及血小板，本研究可充分利用开发造血干细胞制备时的废弃物，极大的节约细胞培养成本。

发明内容

有鉴于此，本发明为了克服现有技术和样本问题的不足，提供一种利用脐带血制备血清替代物培养MSCs的方法。