[发明专利]一种多聚酶法快速免疫组化试剂盒及其免疫组化方法

说明书

本发明涉及一种多聚酶法免疫组化试剂盒及其免疫组化方法，该试剂盒包括浓度为10‑20μg/mL的多聚酶HRP标记抗体结合物溶液、DAB显色液和苏木素复染液。本发明的免疫组化方法基于多聚酶技术，采用多个HRP分子聚合成HPR多聚体作为此方法的信号放大系统，采用HRP多聚体与多个一抗分子结合，形成抗体‑HRP结合物作为此方法的反应系统，达到信号放大的效果，无需级联放大。该方法减少了使用二抗的步骤，节约大量时间，同时避免了因二抗产生的非特异性染色。该方法同时满足术中快速检测和术后的临床诊断、疾病研究、指导用药及科学研究等。

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，更具体地，涉及一种多聚酶法快速免疫组化试剂盒及其免疫组化方法。

背景技术

免疫组化用标记的特异性抗体对组织切片或细胞标本中某些化学成分的分布和含量进行组织和细胞原位定性、定位或定量研究的技术，广泛用于临床病理诊断，鉴别诊断、疾病研究、组织学、细胞学等科学研究领域及其他需要免疫组化的领域。

现将其使用领域按照要求分为两类，一类要求在极短时间10-15min得到结果，例如：在术中诊断，常用术中诊断技术为组织化学(HE),但是其容易出现假性判断及对微小癌、初期癌症诊断误判率较高，这时就需要借助免疫组化进行鉴别、辅助外科医师判断病变性质、决定手术方式；另一类针对类似临床诊断、组织、细胞、疾病研究等领域长期需要处理大量切片、涂片，需要简化实验步骤，减少实验时间，提高效率同时对组化结果要求较高，例如：在临床诊断中随着肿瘤的发病率持续增长，由于病理医生较缺乏，工作量大，病理结果的实效性，都要求免疫组化可以实现简单快捷高效的模式。

传统的免疫组化反应时间长、需要8-20h，步骤多，操作较为繁琐，容易产生非特异性染色，无法在术中快速简单准确的完成疾病诊断，也很难为病理医生及生命科学领域的科研人员提供及时的疾病信息和科学数据。

发明内容

针对现有技术中存在的技术问题，本发明提出了一种多聚酶法快速免疫组化试剂盒及其免疫组化方法，该方法利用HRP多聚体直接与多个一抗分子结合，反应只需一步即可完成，显著提高反应速率，减少操作步骤、定位更准确、特异性更高，大幅减少实验时间，为病理医生提供及时准确的疾病信息，避免HE染色出现的假阳性或假阴性以及传统的免疫组化耗时长，贻误病情。

为实现上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明的第一个目的在于提出一种多聚酶法免疫组化试剂盒，包括浓度为10-20μg/mL的多聚酶HRP标记抗体结合物溶液、DAB显色液和苏木素复染液。

进一步地，所述多聚酶HRP标记抗体结合物溶液浓度为10-20μg/mL。

更进一步地，所述多聚酶HRP标记抗体结合物溶液是采用抗体稀释液稀释多聚酶HRP标记抗体结合物制备而成；所述抗体稀释液包括5g/L的酪蛋白、1g/L的牛血清蛋白、质量浓度为0.1％的吐温20、质量浓度为0.04％的Proclin300。

进一步地，所述多聚酶HRP标记抗体结合物的制备方法为：

1)氧化反应：取8mg辣根过氧化物酶，加8mmol NaIO4，反应20分钟，得到含醛基的HRP；

2)聚合形成多聚酶：步骤1)得到的含醛基的HRP中加入2ml质量浓度为3％的非离子表面活性剂，再用1M Na2CO3-NaHCO3溶液调pH至8.8-9.2，然后4℃旋转反应过夜得多聚酶；所述的非离子表面活性剂为TritonX-100；

3)纯化：步骤2)得到的多聚酶用10mM磷酸盐生理缓冲液透析换液3次，得透析物；

4)连接一抗：取出步骤3)得到的透析物，加入适用于临床诊断的抗体；用10μl浓度为1M的Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲溶液调pH至8.3-8.7，旋转反应4小时；