[发明专利]一种多聚酶法快速免疫组化试剂盒及其免疫组化方法

权利要求书

1.一种多聚酶法免疫组化试剂盒，其特征在于，包括浓度为10-20μg/mL的多聚酶HRP标记抗体结合物溶液、DAB显色液和苏木素复染液。

2.根据权利要求1所述的一种多聚酶法免疫组化试剂盒，其特征在于，所述多聚酶HRP标记抗体结合物溶液浓度为10-20μg/mL。

3.根据权利要求1或2任一所述的一种多聚酶法免疫组化试剂盒，其特征在于，所述多聚酶HRP标记抗体结合物溶液是采用抗体稀释液稀释多聚酶HRP标记抗体结合物制备而成；所述抗体稀释液包括5g/L的酪蛋白、1g/L的牛血清蛋白、质量浓度为0.1％的吐温20、质量浓度为0.04％的Proclin300。

4.根据权利要求1所述的一种多聚酶法免疫组化试剂盒，其特征在于，所述多聚酶HRP标记抗体结合物的制备方法为：

1)氧化反应：取8mg辣根过氧化物酶，加8mmol NaIO4，反应20分钟，得到含醛基的HRP；

2)聚合形成多聚酶：步骤1)得到的含醛基的HRP中加入2ml质量浓度为3％的非离子表面活性剂，再用1M Na2CO3-NaHCO3溶液调pH至8.8-9.2，然后4℃旋转反应过夜得多聚酶；所述的非离子表面活性剂为TritonX-100；

3)纯化：步骤2)得到的多聚酶用10mM磷酸盐生理缓冲液透析换液3次，得透析物；

4)连接一抗：取出步骤3)得到的透析物，加入适用于临床诊断的抗体；用10μl浓度为1M的Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲溶液调pH至8.3-8.7，旋转反应4小时；

5)还原稳定化：加入120μl浓度为5mg/ml NaHB₄，摇匀，室温静置还原90分钟；

6)纯化：10mM磷酸盐生理缓冲液透析，换液3次，取出透析物，得多聚酶HRP标记抗体结合物。

5.一种基于权利要求1-4任一所述多聚酶法免疫组化试剂盒的快速免疫组化方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)取新鲜组织冰冻切片；

(2)组织切片固定，晾干，PBS冲洗；

(3)抗体孵育：滴加多聚酶HRP标记抗体结合物溶液，孵育2-6min后用PBS冲洗；所述多聚酶HRP标记抗体结合物溶液浓度为10-20μg/mL；

(4)滴加DAB显色2-5min后，PBS冲洗；

(5)苏木精染色2-3min，水洗后封固。

6.根据权利要求5所述的一种快速免疫组化方法，其特征在于，所述步骤(3)中抗体孵育时间为3-4min。

7.一种基于权利要求1-4任一所述多聚酶法免疫组化试剂盒的免疫组化方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)石蜡切片脱蜡-水化-修复/冰切固定；

2)3％H₂O₂阻断13-18min，PBST/TBST冲洗3*5min；

3)孵育多聚酶标记抗体37℃25-35min，PBST/TBST冲洗3*5min；

4)滴加DAB显色2-5min后，PBS冲洗30s；

5)苏木精染色2-3min，蓝化液返蓝；

6)脱水-透明-封片。