[发明专利]一种用于检测具核梭杆菌的试剂盒及其方法

说明书

本发明涉及一种用于检测具核梭杆菌的试剂盒，其包括：探针‑杂交缓冲液混合体系；其中，所述探针‑杂交缓冲液混合体系包括报告分子标记的具核梭杆菌特异探针或者荧光标记的具核梭杆菌特异探针；其中，当采用报告分子标记的具核梭杆菌特异探针时，所述试剂盒还包括与报告分子发生免疫化学反应的荧光标记的特异亲和素。本发明还涉及一种采用上述试剂盒检测具核梭杆菌的方法。本发明采用的荧光原位杂交技术结合了分子生物学的精确性和形态学分析的可视性，实现在组织切片原位直接观察具核梭杆菌的分布以及数量，同时采用组织作为对照，可以精确定位菌体的位置，实现了对具核梭杆菌的定性和定位分析。

技术领域

本发明属于及生物检测技术领域，尤其涉及一种用于检测具核梭杆菌的试剂盒及其方法，其采用荧光原位杂交检测方法。

背景技术

现有对大肠癌组织或者粪便中的具核梭杆菌进行定性和定位分析主要包括：(1)传统的微生物鉴定及群落分析，其多采用菌种分离培养的方法，传统微生物鉴定及群落分析鉴定方法耗时长、效率低，厌氧菌的分离培养又对培养环境有着苛刻的要求，极易出现假阴性的出现；

(2)细菌染色并进行普通光学显微镜或电镜分析等，普通光学显微镜通过细菌的结构以及形态学特征仅仅了解细菌的一些信息，但由于细菌的形态学差异较小，因为简单的光学显微镜鉴定是不准确的；而与电镜相比，虽然电镜的分辨率很高，但其使用的维护成本和时间成本均较高，且操作难度大；

(3)qPCR(Real-time Quantitative PCR实时荧光定量核酸扩增检测)等。PCR技术可定量检测组织中细菌DNA的量进而对微生物群落的状态进行分析，但PCR对样本保存要求较高，影响检测的便捷性，且无法立体直观的观察微生态的形态、数量、空间分布。因而，需要进一步改进具核梭杆菌的检测方法。

荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybrididaization，FISH)技术是一种重要的非放射性分子标记技术，其基本原理是：如果被检测的染色体或DNA纤维切片上的靶DNA与所用的核酸探针是同源互补的，二者经变性-退火-复性，即可形成靶DNA与核酸探针的杂交体。将核酸探针的某一种核苷酸标记上报告分子如生物素、地高辛，可利用该报告分子与荧光素标记的特异亲和素之间的免疫化学反应，经荧光检测体系在镜下对待测DNA进行定性、定量或相对定位分析。

该技术不但可用于已知基因或序列的染色体定位，而且也可用于未克隆基因或遗传标记及染色体畸变的研究。在基因定性、定量、整合、表达等方面的研究中颇具优势。但该荧光原位杂交技术并未应用于微生物(例如具核梭杆菌等)的检测。

发明内容

为了于克服现有技术中的缺陷，本发明解决了之前无法在组织切片原位直接观察具核梭杆菌的分布以及数量的问题，同时采用组织作为对照，可以精确定位菌体的位置，实现了对具核梭杆菌(Fusobacteriumnucleatum)的定性和定位分析。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面是提供一种用于检测具核梭杆菌的试剂盒，其包括：探针-杂交缓冲液混合体系；其中，所述探针-杂交缓冲液混合体系包括荧光标记的具核梭杆菌特异探针。

进一步地，所述探针-杂交缓冲液混合体系还包括荧光标记的肠道菌群通用探针。

进一步地，所述荧光标记的具核梭杆菌特异探针序列如SEQ ID NO：3所示，所述荧光标记的肠道菌群通用探针的序列如SEQ ID NO：4所示。

进一步地，所述荧光标记选自FITC、TRITC、CY3、CY5、thiol、DEAC；更进一步地，所述具核梭杆菌特异探针标记FITC或CY3，所述肠道菌群通用探针标记FITC或DEAC(Diethylaminocoumarin-5-dutp二乙胺基香豆素)。荧光标记也可采用本领域任一合适的荧光素。