[发明专利]一种用于检测具核梭杆菌的试剂盒及其方法

权利要求书

1.一种用于检测具核梭杆菌的试剂盒，其特征在于，包括：探针-杂交缓冲液混合体系；其中，所述探针-杂交缓冲液混合体系包括报告分子标记的具核梭杆菌特异探针或者荧光标记的具核梭杆菌特异探针；其中，当采用报告分子标记的具核梭杆菌特异探针时，所述试剂盒还包括与报告分子发生免疫化学反应的荧光标记的特异亲和素。

2.根据权利要求1所述的用于检测具核梭杆菌的试剂盒，其特征在于，所述报告分子选自生物素、地高辛，所述特异亲和素选自抗生物素抗体、抗地高辛抗体。

3.根据权利要求1所述的用于检测具核梭杆菌的试剂盒，其特征在于，所述探针-杂交缓冲液混合体系还包括相对应的报告分子标记的肠道菌群通用探针或者荧光标记的肠道菌群通用探针。

4.根据权利要求3所述的用于检测具核梭杆菌的试剂盒，其特征在于，所述报告分子为地高辛，所述特异亲和素为抗地高辛荧光标记抗体；其中，地高辛标记的具核梭杆菌特异探针的序列如SEQ ID NO：1所示，地高辛标记的肠道菌群通用探针的序列如SEQ ID NO：2所示，荧光标记的具核梭杆菌特异探针序列如SEQ ID NO：3所示，荧光标记的肠道菌群通用探针的序列如SEQ ID NO：4所示。

5.一种采用权利要求1～4中任一项所述的试剂盒检测具核梭杆菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1)常规制备组织切片后，进行脱蜡处理；

步骤2)对脱蜡后的组织切片进行清洗并对其上的细菌细胞壁进行消化；

步骤3)将组织切片梯度脱水并晾干，在组织切片上加入探针-杂交缓冲液混合体系，并封片进行孵育；

步骤4)使用无探针的杂交缓冲液对组织切片进行浸洗，PBS溶液漂洗组织；

步骤5)复染组织中的DNA，封片，拍照；

步骤6)寻找荧光标记信号对细菌进行定位分析，并确定荧光信号在切片中的位置，分析细菌所处的空间位置。

6.根据权利要求5所述的检测具核梭杆菌的方法，其特征在于，当采用报告分子标记的具核梭杆菌特异探针时，所述方法在步骤4)之后及步骤5)之前包括：步骤41)将洗涤缓冲液稀释好的与报告分子发生免疫化学反应的荧光标记的特异亲和素滴在杂交区域，避光孵育，用PBS溶液浸洗。

7.根据权利要求5所述的检测具核梭杆菌的方法，其特征在于，所述步骤2)中的组织切片清洗及其细菌细胞壁的消化包括如下步骤：

a)使用2×SSC缓冲液，室温浸泡切片3～8min；

b)配置溶菌酶溶液，以用于浸泡组织切片，孵育15～25min，漂洗；

c)使用2×SSC缓冲液，室温浸泡切片3～8min。

8.根据权利要求7所述的的检测具核梭杆菌的方法，其特征在于，如果组织切片保存时间大于等于1年，在步骤c)之后还包括步骤：

d)将组织切片至于多聚甲醛溶液中固定5～15min；

e)使用2×SSC缓冲液，室温浸泡切片3～8min。

9.根据权利要求5所述的检测具核梭杆菌的方法，其特征在于，在所述步骤3)中，梯度脱水的步骤包括：将组织切片依次浸入75％乙醇水溶液，80％乙醇水溶液，100％无水乙醇，每缸乙醇体积为承载组织的载玻片体积5倍以上，每缸浸洗2～3min；所述杂交缓冲液的pH值为7.0-7.5，探针浓度为5～30ng/ul，孵育温度55-60℃，时间3.5-4.5小时，过程中保持环境湿度60％以上。

10.根据权利要求5所述的检测具核梭杆菌的方法，其特征在于，在所述步骤4)中，采用无探针的杂交缓冲液浸洗5～10min，46℃一次，使用PBS溶液漂洗组织，在所述步骤5)采用4',6-二脒基-2-苯基吲哚复染组织中的DNA，封片，-20℃冻存1h之后，在暗室中使用荧光显微镜观察杂交信号并拍照。