[发明专利]一种血液ctDNA的微卫星不稳定性检测方法

说明书

本发明公开了一种血液ctDNA的微卫星不稳定性的检测方法。本发明方法是包括对包含ctDNA的cfDNA进行探针捕获，根据获得的目标产物建立测序文库和上机测序；对下机数据进行拆分、质控、过滤和比对；然后通过perl程序对微卫星位点序列提取，并和正常的微卫星序列进行对比，检测微卫星位点的突变情况并记录其突变类型，最后根据统计各个微卫星位点的稳定性评估样本的整体的微卫星稳定性状态。本发明不仅能有效准确的检测出样本的微卫星不稳定性的状态，还能检测微卫星不稳定位点的突变情况。本发明方法相比传统PCR检测方法更快速和方便，成本更低，检测更全面。

技术领域

本发明属于生物信息技术领域，具体涉及一种血液ctDNA的微卫星不稳定性检测方法。

背景技术

微卫星序列(Microsatellite，MS)或简单串联重复序列(Simple SequenceRepeat，SSR)广泛存在于原核及真核基因组中，是由10～50个1～6个核苷酸组成的重复单位串联组成的具有高度多态性的简单串联序列。微卫星不稳定性(Microsatelliteinstability，MSI)是由于复制错误导致微卫星区域出现碱基对的插入或缺失的表型。与正常组织的DNA相比，有微卫星不稳定性的DNA序列在电泳的时候出现等位带的移动、带的强度增加或获得额外的带型。微卫星不稳定性发生的主要原因很可能是由于配对错误修复基因功能异常而导致正常的蛋白质合成出错，产生了一种有缺陷的蛋白质。因为此蛋白质不能正常地发挥调控作用，从而导致细胞增殖和分化异常，促进了癌症的形成和发展。

至今为止，几乎所有的人类的肿瘤研究都有微卫星不稳定性的情况，虽然结果有一定的差异，但能明确的表明微卫星序列突变会促使正常细胞向恶性肿瘤细胞转化。所以现在微卫星不稳定性已经成为恶性肿瘤筛查的一个指标。因为微卫星不稳定性与大多数癌症早期发生有关，所以检测微卫星不稳定能有助于提高早期癌症的诊断率。甚至对于许多恶性肿瘤来说，微卫星不稳定性检测具有判断预后和指导治疗的作用。例如结直肠癌遗传学研究显示约15％的原发性结直肠癌和大部分的林奇综合症(Lynch syndrome)都是由微卫星不稳定所导致的，而且高度微卫星不稳定性是1期结直肠癌患者预测康复良好的一个标志物。2015年美国国立综合癌症网络(national comprehensive cancer network，NCCN)指南指出二期微卫星不稳定性的结直肠癌患者不应该接受5-FU为基础的化疗方案。同年美国临床肿瘤学会(American Society of Clinical Oncology，ASCO)指出三期微卫星不稳定性的结直肠癌患者可以从5-FU为基础的化疗方案中获益。近期研究表明，高度微卫星不稳定性患者在接受PD-1和PD-L1抗体时有良好的预后，所以微卫星不稳定性可能是免疫检查点阻断疗法的一个标志物。

根据美国国立癌症研究院协作组推荐的微卫星不稳定性检测方法，首先对5个微卫星位点(BAT-26、BAT-25、NR-21、NR-24和NR-27)进行PCR扩增，然后根据PCR的结果来对微卫星不稳定性进行分类，结果可分为以下三类：微卫星稳定(MSS)：通过PCR检测的5个微卫星位点中没有一个微卫星位点显示不稳定；低频微卫星不稳定性(MSI-L)：通过PCR检测的5个微卫星位点中有1个标记位点显示不稳定或者通过PCR检测的多个微卫星位点中有10％到30％的标记位点为不稳定；高频微卫星不稳定(MSI-H)：通过PCR检测的5个微卫星位点中有2个或以上表示不稳定或通过PCR检测的多个微卫星位点中30％以上的位点表示不稳定。