[发明专利]一种血液ctDNA的微卫星不稳定性检测方法

权利要求书

1.一种血液ctDNA的微卫星不稳定性的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)提取包含ctDNA的cfDNA后，进行探针捕获，对获得的目标产物建立测序文库，然后对文库中的序列上机测序，测序读长为150bp；

(2)下机拆分步骤(1)获得的测序数据，并对拆分的数据进行质控和过滤，将数据和人类参考基因组进行比对，获取比对数据后建立比对数据的索引和去除重复序列；

(3)从步骤(2)的比对结果中提取包含微卫星位点的测序序列，并对所述序列进行分类计数，获得每种测序序列的置信值，抛弃低置信值的序列，将合格的所述序列与正常的微卫星位点序列进行比对；

(4)通过步骤(3)的比对结果获得该位点的微卫星不稳定性和突变情况，通过微卫星不稳定性位点的数目和检测出微卫星位点的总数的比例确定样本微卫星序列的稳定性。

2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(1)中cfDNA提取后将其DNA分子随机打断，并对cfDNA片段进行末端修复并在3’端添加A碱基；所述探针捕获中所使用的特异性探针为具有特异性的小片段DNA序列。

3.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(2)中的过滤是通过fastq软件过滤掉质量不合格，N含量过多的序列；采用bwa软件将过滤后的数据和人类参考基因组做比对，找到每条测序的序列在人类参考基因组中的位置；采用samtools软件获取比对后的数据。

4.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(3)中提取包含微卫星位点的测序序列采用perl程序，并过滤深度较低和比对质量较差的测序序列；所述低置信值的序列为置信值低于0.05的测序序列。

5.如权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(3)中测序序列的置信值统计方法如下：把包含相同微卫星位点的测序序列进行分类并计数，计算每种测序序列的数目与数目最多的测序序列的比例，如果比率低于5％，则认为此微卫星序列情况不可信并抛弃此序列，最后把比例作为此序列的置信值。

6.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(4)中通过perl程序获得该位点的微卫星不稳定性和突变情况。

7.如权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(4)中对包含微卫星位点的测序数据进行突变情况识别的方法如下：

提取正常序列中微卫星序列中的重复单位和其重复数，以其重复单位为种子，在提取的微卫星位点的不同序列中寻找相连的重复单位并计算其重复出现的次数；比较其重复次数和正常序列次数做对比，如果重复数少于正常序列的重复数，则视为发生缺失突变，如果重复数多于正常序列的重复数，则视为发生插入突变；如果序列中有两处连续重复的种子序列，且它们重复数总数比正常序列的重复数少一个和它们之间间隔一个种子序列的长度，则视为这个序列发生了单核苷酸突变；如果这个微卫星位点所有的序列都没有发生突变则视为该点微卫星稳定。

8.如权利要求6所述的检测方法，其特征在于，步骤(4)中样本微卫星序列的稳定性检测结果确定方法如下：

统计所有检测出的微卫星位点数目和微卫星不稳定性位点的数目，如果微卫星不稳定性位点数目占所有检测出的微卫星位点数目的30％以上，则认为高频微卫星不稳定；如果微卫星不稳定性位点数目占所有检测出的微卫星位点数目的比值在10％～20％之间，则认为低频微卫星不稳定；如果微卫星不稳定性位点数目占所有检测出的微卫星位点数目的10％以下，则认为微卫星稳定。

9.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(1)中的使用的测序仪为illumina NextSeq CN500测序仪；所述测序方式为双端测序，探针为具有特异性的小片段DNA序列。

10.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(1)中的cfDNA来自于肿瘤患者的外周血。