[发明专利]用于肺炎支原体检测的PCR-内控核酸试纸条检测方法

说明书

本发明公开了基于PCR‑内控核酸试纸条的肺炎支原体检测方法，具体按照下述步骤进行：针对肺炎支原体的16S rRNA核酸序列设计修饰有地高辛和生物素的MP特异性引物，针对人β珠蛋白基因的核酸序列设计修饰有地高辛和荧光素Cy3的β珠蛋白基因引物；提取待测样本的DNA、以待测样本的DNA为模板，以MP特异性引物和β珠蛋白基因引物为引物进行PCR扩增得到待测样本DNA扩增产物，并加入UNG酶防污染技术和内控分别用于避免假阳性和假阴性结果。将待测样本DNA扩增产物使用肺炎支原体检测内控核酸试纸条进行检测。本发明基于PCR‑内控核酸试纸的肺炎支原体检测方法，操作简单，能够快速检测肺炎支原体。

技术领域

本发明属于分子生物检测技术领域，涉及一种基于PCR-内控核酸试纸条的肺炎支原体检测方法。

背景技术

肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae,MP)是引起呼吸道感染最常见的病原微生物之一，其目前发病率呈现出上升的趋势且可引起多系统病变。肺炎支原体缺乏细胞壁，使其对影响细胞壁合成的抗生素具有本质耐药性，临床上应选择抑制或影响蛋白质和核酸合成的药物来治疗，如大环内醋类、喳诺酮类、氨基糖普类、四环素类等。由于大部分药物对儿童正常生长发育有不良反应，目前大环内酯类是首选药物。随着大环内酷类抗生素的广泛应用，肺炎支原体对该抗生素耐药性呈现出逐年升高趋势。肺炎支原体感染临床表现不具有特征性，容易和其他病毒、细菌所致的呼吸道感染相混淆，且常与其它病原菌发生混合感染，因此临床需要一种灵敏、快速、特异的检测方法来早期确诊肺炎支原体肺炎，以便及时、正确用药，减少并预防耐药性。

目前肺炎支原体检测的方法主要有分离培养、血清学抗体检测和PCR诊断。但是肺炎支原体分离培养进行检测时需要耗费较长的时间，且培养条件苛刻，灵敏度不高，用于临床诊断意义不大；而目前进行血清科学抗体检测主要有两大类：一类是血清肺炎支原体抗体IgM或IgG检测，一类是肺炎支原体核酸(MP-DNA)检测。血清学检测简便快捷，在临床上得到了广泛的应用。但这种方法仅对既往感染能提供较好的检测指标，而对现症感染考核的应用价值较低，

荧光定量PCR是MP-DNA检测中最常用的方法，但该方法操作复杂，且存在荧光探针、仪器价格昂贵等问题，许多基层临床单位尚不能开展。所以研究并开发用于MP检测关键技术和相关检测产品具有重大临床意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于PCR-内控核酸试纸条的肺炎支原体检测方法，操作简单，能够快速检测肺炎支原体。

本发明采用的技术方案是，基于PCR-内控核酸试纸条的肺炎支原体检测方法，具体按照下述步骤进行：

步骤1，针对肺炎支原体的16S rRNA核酸序列设计修饰有地高辛和生物素的MP特异性引物；

针对人β珠蛋白核酸序列设计修饰有地高辛和荧光素Cy3的β珠蛋白基因引物；

提取待测样本的DNA；

步骤2，以待测样本的DNA为模板，以MP特异性引物和β珠蛋白基因引物为引物同时进行PCR扩增，得到扩增产物；

步骤3，将扩增产物使用肺炎支原体检测金磁免疫层析试纸条进行检测。

本发明的特点还在于：

MP特异性引物为：

MP-F：5’-Digoxin–AAGGACCTGCAAGGGTTGT-3’；

MP-R：5’-Biotin-CTCTAGCCATTACCTGCTAA-3’；

β珠蛋白基因引物为：

β-Globin-F：5’-Digoxin-ACAGAACTGTGTTCACTAGC-3’；