[发明专利]用于肺炎支原体检测的PCR-内控核酸试纸条检测方法

权利要求书

1.基于PCR-内控核酸试纸条的肺炎支原体检测方法，其特征在于，具体按照下述步骤进行：

步骤1，针对肺炎支原体的16S rRNA核酸序列设计修饰有地高辛和生物素的MP特异性引物；

针对人β珠蛋白核酸序列设计修饰有地高辛和荧光素Cy3的β珠蛋白基因引物；

提取待测样本的DNA；

步骤2，以待测样本的DNA为模板，以所述MP特异性引物和β珠蛋白基因引物为引物同时进行PCR扩增，得到扩增产物；

步骤3，将所述扩增产物使用肺炎支原体检测内控核酸试纸条进行检测。

2.根据权利要求1所述的基于PCR-内控核酸试纸条的肺炎支原体检测方法，其特征在于，所述MP特异性引物为：

MP-F：5’-Digoxin–AAGGACCTGCAAGGGTTGT-3’；

MP-R：5’-Biotin-CTCTAGCCATTACCTGCTAA-3’；

所述β珠蛋白基因引物为：

β-Globin-F：5’-Digoxin-ACAGAACTGTGTTCACTAGC-3’；

β-Globin-R：5’-Cy3-CATCAGGAGTGGACAGATCC-3’。

3.根据权利要求1所述的基于PCR-内控核酸试纸条的肺炎支原体检测方法，其特征在于，所述步骤2中PCR扩增程序为：

UNG酶50℃2min；95℃预变性5min；94℃变性30s,54℃退火30s，72℃延伸1min，进行30个循环；72℃完全延伸1min。

4.根据权利要求3所述的基于PCR-内控核酸试纸条的肺炎支原体检测方法，其特征在于，进行PCR扩增时，按照体积分数，向PCR管加入10％的10×Taq buffer、8％的d NTP(A:U:C:G)、1％的HotMaster Taq DNA酶、1％的UNG酶、2％～5％的MP特异性引物、2％～5％的β珠蛋白基因引物、2％～10％的模板和60％～74％的dd H₂O。

5.根据权利要求1所述的基于PCR-内控核酸试纸条的肺炎支原体检测方法，其特征在于，所述肺炎支原体检测内控核酸试纸条包括PVC胶板(1)，所述PVC胶板(1)上表面上呈线性依次固接有上样垫(2)、结合垫(3)、层析膜(4)和吸水纸(5)；所述上样垫(2)与结合垫(3)部分贴合，所述结合垫(3)与层析膜(4)部分贴合，所述层析膜(4)与吸水纸(5)部分贴合；所述结合垫(3)上喷涂有地高辛抗体包被的金磁纳米微粒，所述层析膜(4)上嵌有检测线T(6)、内控线IC(7)和质控线C(8)，所述检测线T(6)上包被有链霉亲和素，所述内控线IC(7)上包被有Cy3抗体，所述质控线C(8)上包被有羊抗鼠IgG，所述检测线T靠近免疫金磁微粒标记的结合垫(3)端，内控线IC(7)位于检测线T(6)和质控线C(8)之间。

6.跟权利要求5所述的基于PCR-内控核酸试纸的肺炎支原体检测方法，其特征在于，所述上样垫(2)和结合垫(3)的材质均为亲水性的聚酯纤维，所述层析膜(4)为硝酸纤维素薄膜。

7.根据权利要求5所述的基于PCR-内控核酸试纸的肺炎支原体检测方法，其特征在于，所述步骤3中具体按照下述方法进行：

步骤3.1，将步骤2得到的待测样本DNA扩增产物滴加至上样垫(2)上；

步骤3.2，观察肺炎支原体检测内控核酸试纸条上的检测线T(6)、内控线IC(7)和质控线C(8)，若质控线C(8)、内控线IC(7)和检测线T(6)均发生显色反应，则检测结果为阳性，说明待测样本中含有肺炎支原体靶片段；

若质控线C(8)、内控线IC(7)显色而检测线T(6)不显色，则说明待测样本中不含肺炎支原体靶片段；

若仅质控线C(8)显色而内控线IC(7)、检测线T(6)均不显色，则表明检测全过程中某一步或某几步出现问题，试纸条结果不可信，重新进行检测；

若质控线C(8)不显色，则更换肺炎支原体检测内控核酸试纸条进行检测。