[发明专利]一种山桐子高质量DNA提取方法

说明书

本发明属于DNA提取技术领域，公开了一种山桐子高质量DNA提取方法。本发明以CTAB法为框架，研磨时加入防氧化剂，裂解前，进行PEG洗脱，并优化后续CTAB法操作步骤，形成包括材料采集、材料研磨、PEG洗脱、CTAB裂解、萃取、DNA沉淀与收集等步骤的一种山桐子高质量DNA提取方法。本方法提取的山桐子DNA，浓度高，纯度高，DNA质量显著优于现有方法，浓度平均为438.93ng/ul，为试剂盒法的8.5倍，OD260/280比值在1.94‑1.97间，OD260/230比值在2.1‑2.17间，蛋白质污染，DNA糖类与盐污染均得到极好控制，DNA完整。实施例显示，本法提取的山桐子DNA可以满足SSR标记分型、简化基因组测序等分子试验所需；同时本方法不使用苯酚进行复萃取，在简化试验步骤，缩短试验时间的同时，也减少有机溶剂对人体健康的损害。

技术领域

本发明属于DNA提取方法技术领域，尤其涉及一种山桐子高质量DNA提取方法。

背景技术

山桐子，又称“油葡萄”，适应性强，耐旱，耐贫瘠，单株产果量高，全果含油，油脂品质高，兼具多种保健功能，是重要的木本油料物种，被誉为树上油仓。同时山桐子树形优美，秋日果实深红色，圆锥状下垂，也是优良的园艺观赏树种。近年来，山桐子产业目前在我国大有星火燎原之势，在全国各地正迅猛发展。但山桐子童期长，雌雄异株、且雄株多的生物学特点，不利于山桐子产业的快速发展，急需开展山桐子雌雄分化、油脂形成等方面的多种分子生物学研究，在此基础上，建立山桐子分子辅助育种体系，以加速山桐子产业发展。

从生物体中提取DNA是进行分子生物学研究的基础，山桐子其叶片和其他组织中富含大量的多糖、多酚、类菇烯等多种初生与次生代谢产物，提取高质量的DNA比较困难，属于一种顽拗植物。常用的提取植物核酸的方法如，SDS法、CTAB法等只适用于部分植物，运用于山桐子DNA提取时存在较大局限性。SDS法操作简单，温和，通过该方法可提取到一定量的山桐子DNA，但提取量浓度较小，所得到的产物质量与纯度不高，含糖类、蛋白质、盐类杂质较多。通过CTAB法，可提取较多量的山桐子DNA，有所减轻蛋白质污染，DNA纯度有所提高，但操作中因苯酚的使用，酚类污染仍严重，且各山桐子样本DNA浓度与纯度变异幅度较大，试验中多次抽提试验周期较长。随着提取技术的发展，基于高效核酸吸附柱的DNA提取试剂盒出现，大大提高了DNA提取效率。但尽管试剂盒法提取的山桐子DNA纯度得以提升，然而提升幅度较少，且各山桐子样本DNA浓度仍较低，在此基础上，初步展开的SSR等标记分型条带清晰度也有待提高。受限于此，山桐子相关分子生物学研究进展缓慢。据此，本文对CTAB法进行改良，以期提供一种山桐子高质量基因组DNA提取方法，为山桐子分子生物学研究提供技术基础。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明以CTAB法为框架，研磨时加入防氧化剂，裂解前，进行PEG洗脱，优化与简化后续CTAB法操作步骤，形成适宜山桐子高质量DNA提取方法。

本发明目的是提供一种山桐子高质量DNA提取方法，包括以下步骤：

S1，材料采集：采集各样本山桐子嫩叶，然后装于冻存管立即存于液氮中，转移至-80℃冰箱保存；

S2，材料研磨：将嫩叶放入研钵中，加入液氮充分研磨，研磨样品时加入了1/10样本重量的防氧化剂，混合粉末加入2ml离心管中；

S3，PEG洗脱：向装有样品粉末的2ml离心管中加入1-1.2mlPEG洗脱液，翻转混匀，室温静止片刻，离心收集沉淀，重复洗涤多次；

S4，CTAB裂解：向经PEG漂洗液的材料中加入1ml裂解液，65℃裂解后，离心取上清；

S5，萃取：向S4中所得上清液，加入同体积的氯仿:异戊醇(24:1)混合液，翻转混匀，静置5min，12000rpm离心10min，将上清转入一新的2ml的离心管中；反复该步骤2-3次；