[发明专利]一种I型胶原蛋白三螺旋结构完整性的判定新方法

说明书

本发明公开一种I型胶原蛋白三螺旋结构完整性的判定新方法，属于生物检测技术领域，其基本原理为具有完整三螺旋结构的胶原蛋白对蛋白酶的酶解具有抗性，而三螺旋结构丧失或者部分丧失的胶原蛋白易于被蛋白酶分解成小分子量的肽段，通过SDS‑PAGE可以对被分解的肽段进行可视化分析，被分解的肽段越多，则表明胶原蛋白样品三螺旋结构的完整性越差；反之，如果SDS‑PAGE没有被分解的小分子肽段的出现，则表明胶原蛋白样品三螺旋结构的完整性较好；本发明还可以通过凝胶电泳成像系统或薄层扫描系统对胶原蛋白样品中二聚体蛋白进行定量检测，从而计算胶原蛋白样品的三螺旋结构的保留率，弥补了定性检测的不足；通过本方法来判断胶原蛋白三螺旋结构的完整性，结果重现性好，特异性强，操作简单，可用于胶原蛋白产品的检测。

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种I型胶原蛋白三螺旋完整性的判定及三螺旋结构保留率的计算方法。

背景技术

I型胶原蛋白是由三条肽链形成的右手超螺旋纤维状蛋白质，是动物结缔组织中重要的蛋白质。结缔组织因为有较高含量的胶原蛋白，所以具有一定的结构与机械力学性质，如张力强度、拉力、弹力等以达到支撑和保护机体的作用。由于胶原蛋白有诸多优良性质，使得这类生物高分子化合物的用途非常广泛，遍及医药、化工、食品等领域，其中生物材料与医药方面的应用是目前研究的主要课题。

胶原蛋白产品的不同用途主要取决于胶原蛋白的制备工艺。因制备工艺不同，胶原蛋白产品的结构不同。其中以医疗器械、细胞培养和部分美容护肤品所需的胶原蛋白结构要求最高，要求提取出的胶原蛋白保持完整的三螺旋结构。然而，胶原蛋白的三螺旋结构极易受到加工环境与其他外界条件的影响，如外界的温度、压力和加工生产时引入的化学试剂等因素，这些因素都会导致胶原蛋白三螺旋结构的破坏，影响其生物活性。

目前，胶原蛋白三股螺旋结构完整性的检测方法主要为圆二色谱法、红外光谱法和测定酶解液中羟脯氨酸含量的方法。

据检索，发现如下几篇与本专利申请相关的专利文献：

1、专利文献CN108659117.A公开了一种定量检测胶原蛋白三股螺旋结构含量的方法，它是利用具有完整三股螺旋结构的胶原蛋白不能被胰蛋白酶酶解，而三股螺旋结构破坏的胶原蛋白能被胰蛋白酶酶解的原理，通过测定胰蛋白酶酶解前后胶原蛋白溶液体系中胶原蛋白的特征氨基酸—羟脯氨酸的含量变化，计算得胶原蛋白完整三股螺旋结构的含量。

2、专利文献CN106383232.A公开了一种利用二硫化物纳米材料检测胶原蛋白三重螺旋结构的方法，它是通过二硫化物纳米材料能够准确的检测胶原蛋白的三重螺旋结构的原理实现的，步骤如下：将二硫化物纳米材料溶液加入到探针多肽溶液中，形成第一体系；将二硫化物纳米材料溶液加入到探针多肽溶液和待测多肽溶液的混合溶液中，形成第二体系；检测并判断第一体系和第二体系的荧光强度大小，以确定第二体系中探针多肽与待测多肽是否生成了胶原蛋白三重螺旋结构；其中，所述第一体系中的探针多肽的浓度与所述第二体系中探针多肽的浓度相等，探针多肽为用荧光分子进行修饰过的具有特定序列的胶原多肽。

上述文献与本申请相关性较大，与其相比，本发明方法对I型胶原蛋白三螺旋完整性的判定更为准确，操作性更强。与专利文献CN108659117.A提出的方法相比较，本发明方法测定的是不完整的胶原蛋白三螺旋结构被蛋白酶酶解，从而生成的小分子量的肽段，避免了在利用三氯乙酸沉淀法时，三氯乙酸浓度、温度和离子强度等因素对胶原蛋白沉淀的影响，即因三氯乙酸浓度、温度和离子强度不同，可能会导致沉淀物质及沉淀效果不同，同时沉淀中是否保留不完整的胶原蛋白三螺旋结构和上清液中是否存在完整的胶原蛋白三螺旋结构仍需进一步探究。与专利文献CN106383232.A提出的方法相比，本发明方法不涉及荧光探针的制备，同时解决了高粘度胶原体系中三螺旋结构完整性判断的难题。因此本发明提出的方法具有影响因素较少，结果重现性好，可信度高，且操作简单等优点。

发明内容