[发明专利]一种I型胶原蛋白三螺旋结构完整性的判定新方法

权利要求书

1.一种I型胶原蛋白三螺旋结构完整性的判定新方法，其特征在于，所述方法如下：

（1）取待测胶原蛋白原料样品，加入预冷的0.1-0.5M酸性溶液于低温下溶解并分装于A、B两管中，加入适量蛋白酶；

（2）A管始终处于低温状态，该低温状态使得胶原蛋白三螺旋结构不再被热力破坏，同时满足蛋白酶酶解所需温度；B管则放入高温状态，该高温状态使得胶原蛋白三螺旋结构则因高温的作用，在边解螺旋的同时边被蛋白酶酶解成小分子量的肽段；所述步骤（2）中A管所处低温状态范围为0-35℃，B管所处高温状态范围为20-80℃，A管的低温值小于B管高温值，使得A管与B管形成鲜明对比；

（3）在设定的时间，分别从A、B管中吸取适量样品于An、Bn管中，并标记；

（4）将步骤（3）中标记的An、Bn管迅速置于冰水浴中，加入蛋白酶抑制剂Pepstatin；

（5）按如上方法重复，依次得到A1、B1 ，A2、B2，A3、B3，A4、B4……An、Bn等样品；

（6）将得到的An、Bn制备电泳样品；

（7）制备2.5-12.5%浓度的SDS-PAGE电泳凝胶，直至凝胶完成；

（8）使用Laemmli法对A1、B1 ，A2、B2，A3、B3，A4、B4……An、Bn等胶原蛋白样品进行电泳；

（9）完成电泳后的样品取胶、固定、染色、脱色、制作干胶、判断；

（10）通过凝胶电泳成像系统或薄层扫描系统对制得的SDS-PAGE或SDS-PAGE干胶中二聚体蛋白进行定量检测，计算胶原蛋白样品三螺旋结构的保留率。

2.根据权利要求1所述的一种I型胶原蛋白三螺旋结构完整性的判定新方法，其特征在于：步骤（1）中原蛋白原料样品包括水产加工的下脚料和动物组织中提取得到，所述水产加工的下脚料包括鱼皮、鱼鳞，所述动物组织包括猪皮、牛皮、牛筋腱。

3.根据权利要求1所述的一种I型胶原蛋白三螺旋结构完整性的判定新方法，其特征在于：步骤（1）中的酸性溶液包括醋酸、柠檬酸和盐酸溶液。

4.根据权利要求1所述的一种I型胶原蛋白三螺旋结构完整性的判定新方法，其特征在于：胶原蛋白原料样品与酸性溶液的反应温度应控制在10℃以下。

5.根据权利要求1所述的一种I型胶原蛋白三螺旋结构完整性的判定新方法，其特征在于：步骤（1）中选用的蛋白酶包括胃蛋白酶和胰蛋白酶，酶与底物的比例为1:100-1:10。

6.根据权利要求1所述的一种I型胶原蛋白三螺旋结构完整性的判定新方法，其特征在于：步骤（3）中设定的时间根据酶反应时间与取样间隔时间应根据处理样品不同作具体调整。

7.根据权利要求1所述的一种I型胶原蛋白三螺旋结构完整性的判定新方法，其特征在于：步骤（4）中添加的蛋白酶抑制剂的量应根据处理样品的不同作具体调整。

8.根据权利要求1所述的一种I型胶原蛋白三螺旋结构完整性的判定新方法，其特征在于：步骤（10）中在定量分析I型胶原蛋白三螺旋结构保留率时，检测的特征物质包括二聚体蛋白和羟脯氨酸含量。

9.根据权利要求1所述的一种I型胶原蛋白三螺旋结构完整性的判定新方法，其特征在于：所述步骤（10）中对制得的SDS-PAGE或SDS-PAGE干胶中特征物质的测定方法包括凝胶电泳成像法和薄层扫描法。