[发明专利]多糖裂解单加氧酶基因PsLMPO10A及其编码蛋白和功能

说明书

本发明公开了一种来源于假交替单胞菌的新菌株Pseudoalteromonas sp.DL‑6的多糖裂解单加氧酶基因PsLMPO10A及其克隆、表达、纯化与应用。以Pseudoalteromonas sp.DL‑6的基因组DNA为模板，以PCR方法获得PsLMPO10A的全长基因，其核苷酸序列全长2631bp，编码875个氨基酸，分子量约55.308kD。利用体外重组表达得到多糖裂解单加氧酶PsLMPO10A蛋白，纯化后的蛋白浓度为1.57mg/mL，蛋白总量15.7mg。通过PCR技术扩增目的基因，表达载体pET22b相连接，导入大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达，得到分子量约为55KDa的重组蛋白，经Ni‑NTA亲和柱纯化得到目的蛋白。扫描电子显微镜(SEM)观察PsLMPO10A可破坏粉状几丁质。PsLMPO10A对胶体几丁质、α‑几丁质、β‑几丁质、微晶纤维素和β几丁质纳米须有结合能力。PsLMPO10A可抑制苹果腐烂病。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种多糖裂解单加氧酶(PsLMPO10A)基因，特别涉及一种来源于假交替单胞菌的新菌株Pseudoalteromonas sp.DL-6(CGMCCNo.8580)的单加氧酶基因PsLMPO10A及其克隆、表达与应用。

背景技术

多糖裂解单加氧酶(Lytic polysaccharide monooxygenase,LMPO)是一类氧化水解酶，在动植物及微生物中广泛存在，其活性中心由一个Cu²⁺和两个组氨酸构成，可裂解几丁质、淀粉、纤维素等不溶性多糖，产生寡聚糖醛酸。其属于氧化水解酶的AA10家族。CAZy数据库现(http://www.cazy.org)收录1148个成员，其中5个来源于真核生物，96个来源于病毒，1个来源于古生菌，5个未分类，剩余全部来源于细菌。目前，细菌中38个成员的特性被研究，其中9个溶解性多糖单加氧酶功能得到验证，3个特异降解粉状晶体几丁质，6个特异降解纤维素。8个LMPO晶体结构得到解析，分别为来源于菌株B.amyloliquefaciens(PDB:2yox)、E.faecalis(PDB:4A02)、S.marcescens(PDB:2BEM)、V.cholerae(PDB:2XWX)特异降解几丁质；来源于菌株Burkholderia Pseudomallei(PDB:3UAM)、S.coelicolor A3(2)(PDB:4OY7和4OY6)和Thermobifida fusca YX(PDB:4GBO)特异纤维素底物。为了高效、低成本的生产出在农业、医疗以及食品等行业有着广泛应用的寡糖物质，现在比较新兴的方法是将多糖裂解单加氧酶添加到几丁质酶降解体系中，辅助不溶性多糖的降解，大分子糖链在多糖裂解单加氧酶的作用下断裂，有利于几丁质酶进一步降解，有效的提高反应效率。

纤维素和几丁质是地球上最丰富的两类可再生资源,在开发并转化成生物燃料方面具有广泛的应用前景,同时这也对解决目前的资源、环境和能源问题有着重大意义。传统的酶法降解纤维素和几丁质主要是利用糖苷水解酶系来完成,其通过水解反应来断裂糖苷键。但是,糖苷水解酶对于底物结晶区域的催化效率很低,因而限制了生物质的高效降解。近年来,溶解性多糖单加氧酶(lytic polysaccharide monooxygenases,LPMO)的发现使科学家对于酶法降解结晶多糖有了新的认识。溶解性多糖单加氧酶是一类作用于结晶多糖的氧化酶,其能够通过氧化作用来断裂几丁质(或纤维素)的糖苷键,生成氧化的糖链末端和新的非还原糖链端,使得结晶底物的结构趋于松散,为之后的糖苷水解酶进一步作用提供基础。LPMO主要分布于两大家族:AA9家族(旧称GH61家族)和AA10家族(旧称CBM33家族)。目前，对于LPMO的研究仍有许多问题尚待解决,尤其是AA10家族中LPMO的底物选择性和功能差异性更是值得探讨。因此,发掘并研究新来源的LPMO不仅对于深入探索LPMO具有深远影响而且对于结晶多糖的高效降解有重要意义。

发明内容