[发明专利]多糖裂解单加氧酶基因PsLMPO10A及其编码蛋白和功能

权利要求书

1.本发明提供的单加氧酶基因PsLMPO10A，其特征在于，有如下的核苷酸序列：

2.根据权利要求1所述的单加氧酶PsLMPO10蛋白的制备方法，其特征在于，以假交替单胞菌株DL-6基因组DNA为模板，以PsLMPO10AF引物和PsLMPO10AR引物对进行PCR扩增；

所述引物为：

上游引物PsLMPO10AF:5’-GGAATTCCATATGCATGGTTATATGGAT AGCCCTAAAG-3’

下游引物PsLMPO10AR:5’-CCGCTCGAGCAGTGTGGTCCATACATCGGCTTG-3’

PCR的反应体系为：TaKaRa LATaq(5U/μl)0.5μl，10xLA PCR Buffer 0.5μl，dNTPMixture(各2.5mM)2μl，基因组DNA1μl，上(下)游引物(10μM)2μl，灭菌蒸馏水补足50μl。

PCR反应程序为：94℃ 2min，1个循环；94℃ 30s，55℃ 30s，68℃ 7min，30个循环；68℃15min，1个循环。

3.一种单加氧酶PsLMPO10A的表达与纯化方法，其特征在于，步骤如下：

(1)以权利要求2所述的PCR方法扩增权利要求1所示的核苷酸序列；

(2)构建大肠杆菌克隆载体pMD19-T-PsLMPO10A：将PCR扩增的DNA序列和pMD19-T载体用同样的限制性内切酶进行双酶切，用T₄DNA连接酶连接纯化的酶切产物，得到克隆载体pMD19-T-PsLMPO10A。

(3)构建大肠杆菌表达载体：将pMD19-T-PsLMPO10A质粒转化至E.coli Top10，得到阳性转化子。Nde Ⅰ和Xho Ⅰ将PsLMPO10AchiC基因片段从pMDl9-T-PsLMPO10A上切下，连接到pET-22b表达载体上，转化至E.coli BL21(DE3)，通过菌落PCR、酶切筛选鉴定阳性克隆子，命名为pET22b-PsLMPO10A。

(4)构建大肠杆菌重组表达菌株BL21(DE3)-pET22b-PsLMPO10A:将重组表达质粒pET22b-PsLMPO10A转化至大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)，挑选阳性克隆，得到重组表达菌株BL21(DE3)-pET22b-PsLMPO10A。

(5)所述体外诱导表达的方法为：将重组表达菌株BL21(DE3)-pET22b-PsLMPO10A接入含卡那的LB培养基中，37℃过夜培养14h。按1％的接种量接种到含卡那的LB培养基中。当OD_600nm达到0.6-0.8左右，加入0.2mM的IPTG，20℃，100rpm低温诱导6h。

(6)单加氧酶PsLMPO10A的纯化：诱导表达结束后，4℃，5,000×g,4℃离心5min，收集菌体，用10mL，PBS洗涤菌体三次。最后用10Ml，PBS的缓冲液重悬菌体。离心管置于冰上超声(400w)破碎三次，每次30s，每次间隔1min。4℃，8,000×g离心20min，收集上清液，即为粗蛋白。粗蛋白用Ni²⁺-NTA柱(Novagen)进行亲和层析纯化，得到单加氧酶PsLMPO10A。

4.一种重组单加氧酶PsLMPO10A的应用，其特征在于用作几丁质底物的降解。

5.一种具有几丁质降解的功能的产品，包括权利要求2所述的PsLMPO10A编码蛋白。

6.根据权利要求5所述的重组单加氧酶PsLMPO10A的应用，其特征在于，PsLMPO10A与粉状几丁质结合，经PsLMPO10A处理的几丁质，表面和边缘疏松多孔且粗糙不平，底物的结构遭到破坏，使几丁质酶与底物接触更容易。