[发明专利]一种用于纯化组氨酸标记蛋白质的纳米磁珠的制备方法

说明书

本发明公开了一种用于纯化组氨酸标签蛋白质的纳米磁珠的制备方法；以海藻酸钠，FeCl₃·6H₂O,NaAc·3H₂O和PEG为原料，乙二醇和去离子水为溶剂，通过溶剂热法反应生成单分散的海藻酸钠/Fe₃O₄磁性纳米磁珠，随后纳米磁珠进一步和新加入的海藻酸钠通过环氧氯丙烷交联反应及活化，再引入亚氨基二乙酸(IDA)螯合剂，从而得到与金属镍或钴离子高效螯合的水中稳定的磁性纳米磁珠，实现对组氨酸标签蛋白质高效，快速，简单，低廉的分离纯化。本发明操作简单快速、稳定、成本低，合成的纳米磁珠比表面积大，在水相中稳定不易团聚沉淀，大大地提高了纯化组氨酸标签蛋白质的效率，可用于实现大批量的工业生产。

技术领域

本发明涉及生物材料技术领域，具体涉及一种用于纯化组氨酸标签蛋白质的纳米磁珠的制备方法。

背景技术

目前，组氨酸标签蛋白质的纯化方法主要以琼脂糖或葡聚糖微球作为固相载体，通过化学交联将螯合剂亚氨基二乙酸(IDA)或者氨三乙酸(NTA)固定在微球表面，然后将微球填充柱子，通过亲和层析柱的方式去纯化组氨酸标签蛋白质。但这种柱式纯化方式有几方面的缺陷：1.上样液要求比较高，上样前必须去掉细胞碎片和杂质以免堵塞柱子。2.需要控制上样速度，以免柱子压力过大，造成坍塌。

磁性微球是近年发展起来的新型功能材料，在无外加磁场时分散于溶液中，当有外加磁场时则有较强的磁响应性。基于这个性质，磁性琼脂糖微球被合成及表面功能化，并通过磁性分离来纯化组氨酸标签蛋白质。但由于磁性琼脂糖微球一般在几十到几百微米，容易团聚，在水相中不稳定，易沉淀，比表面积小，和目标蛋白质接触时间短，这样往往需要大量的磁性微球才能纯化到一定量的目标蛋白，此外琼脂糖制备复杂，价格昂贵，这些都大大提高了产品的成本，影响了纯化效率。

通过对现有专利文献的检索发现，申请号为201610163717.7的中国发明专利申请公开了一种复合磁性纳米粒子Fe₃O₄/MPS/PAA/NTA-Ni²⁺及其制备方法和其在分离纯化组氨酸标签蛋白质中的应用；其以平均水合粒径为100～400nm的Fe₃O₄磁性纳米粒为核，采用MPS表面修饰使其表面富含双键，通过PAA包覆得到平均水合粒径为100～600nm的多羧基结构磁性纳米粒子，然后进一步偶联NTA-Ni²⁺得到具有快速磁场响应性的复合磁性纳米粒子Fe₃O₄/MPS/PAA/NTA-Ni²⁺。该发明制得的复合磁性纳米粒子可在纳米尺度上控制包覆层的厚度，制得的复合磁性纳米粒子尺寸分布均匀，具有较高的富集和分离纯化组氨酸标签蛋白质的能力，对组氨酸标签蛋白质的纯化效率可高达40～70μg/mg复合磁性纳米粒子，且可重复使用。然而，此专利合成过程步骤繁多复杂，并且NTA反应效率低(丙烯酸在EDC和NHS的作用下很难和NTA反应)，很难接到磁珠表面，此外整个过程所需反应物多，价格昂贵，如果EDC,NHS，NTA等，反应成本高。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的缺陷和不足，提供一种新型的用于纯化组氨酸标签蛋白质的纳米磁珠的制备方法。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

第一方面，本发明涉及一种用于纯化组氨酸标签蛋白质的纳米磁珠，所述纳米磁珠是外壳为IDA功能化交联海藻酸钠，内核为Fe₃O₄纳米颗粒的核壳结构。

优选的，所述纳米磁珠是粒径为100～200纳米的单分散颗粒。

优选的，所述外壳上海藻酸钠的羧基和表面修饰的IDA螯合剂螯合了金属镍或钴离子。本发明利用海藻酸钠羧基和镍离子结合去纯化组氨酸标记的蛋白质。

第二方面，本发明涉及一种所述的纳米磁珠的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：