[发明专利]一种γ-氨基丁酸的生物制备方法

说明书

本发明提出了一种γ‑氨基丁酸的生物制备方法，其步骤为1)、用能表达谷氨酸脱羧酶的E.coli工程菌株制备谷氨酸脱羧酶全细胞菌体；2)、用味精和浓盐酸制备L‑谷氨酸；3)、L‑谷氨酸作底物溶于水中，加入谷氨酸脱羧酶全细胞菌体和磷酸吡哆醛，搅拌反应，制备γ‑氨基丁酸。本发明方法以水代替缓冲盐溶液构成水相反应体系，以味精代替高纯度谷氨酸，γ‑氨基丁酸纯度高达97.7％，原料成本降低；用于催化的全细胞可由微生物发酵大规模生产，成本低，来源广；生物酶促催化反应为水相反应，酶法转化条件温和，原料转化彻底，后处理简单，采取蒸发浓缩与自然析晶的方法分离产物，成本低、工艺环保，适于产业化生产γ‑氨基丁酸。

技术领域

本发明属于生物化学领域，具体涉及一种γ-氨基丁酸的生物制备方法。

背景技术

γ-氨基丁酸是是哺乳动物中枢神经中的一种重要神经抑制性介质，介导了40％以上的神经抑制性信号。γ-氨基丁酸在人体内发挥着极其重要的生理功能，如促进脑的活化，镇静、抗惊厥，抗癫痫，促进睡眠，延缓脑衰老，补充人体抑制性神经递质，降血压，同时还能抑制脂肪肝及肥胖症，活化肝功能等。此外，γ-氨基丁酸可以作为工业上合成N-甲基吡咯烷酮、生物塑料及尼龙等含氮化学制品的环保型前体物质。因而在食品制药、化工、农业等领域具有十分重要的作用。

γ-氨基丁酸的制备方法主要有化学合成法、微生物合成法和植物富集法。其中植物富集法产量较低；化学合成法反应剧烈、成本高昂、环境污染严重、安全性差；微生物合成法因酶催化方法效率高，专一性强而得到广泛的应用。在微生物合成法制备γ-氨基丁酸的研究中，主要采用谷氨酸脱羧酶法。

谷氨酸脱羧酶能专一、不可逆地催化L-谷氨酸或谷氨酸钠裂解为γ-氨基丁酸和CO₂。但是谷氨酸脱羧酶需要在酸性环境下才能保持活性，引入高浓度的缓冲液将使γ-氨基丁酸的纯化复杂化。通常情况下，高纯度的L-谷氨酸价格比较昂贵。谷氨酸钠价格较低，但转化率低。因此，有必要进一步开发一种高效，低成本，且易于产业化大生产的酶催化制备γ-氨基丁酸的新方法。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提出一种改进的γ-氨基丁酸的生物制备方法，该方法高效、成本低、且易于工业化生产。

为解决以上技术问题，本发明采取以下技术方案：

一种γ-氨基丁酸的生物制备方法，以味精为原料，使味精与浓盐酸反应成为谷氨酸，再以此谷氨酸在水中、在谷氨酸脱羧酶全细胞的催化作用下，搅拌反应得到γ-氨基丁酸。

本发明的具体制备方法为：

1)Gad-pET28a载体的构建

根据GenBank提供的大肠杆菌K-12的Gad基因序列设计引物F、R，以大肠杆菌的基因组DNA为模板扩增Gad基因，凝胶电泳条带约为2000bp，与色氨酸合成酶原基因大小一致；将PCR产物进行纯化，连接到pET28a载体上，得到重组质粒Gad-pET28a，菌落PCR验证后送测序，测序结果表明谷氨酸脱羧酶基因成功插入至载体pET28a；

所述引物F序列(5’-3’)为atgcaccatcatcatcatcatatggataagaagcaagtaacgga；

所述引物R序列(5’-3’)为ctcgagaattgtgagcgctttagtgatcgctgagatatttcaggga；

2)、制备谷氨酸脱羧酶全细胞