[发明专利]一种γ-氨基丁酸的生物制备方法

权利要求书

1.一种γ-氨基丁酸的生物制备方法，其特征在于步骤为：

1）Gad-pET28a载体的构建

根据GenBank提供的大肠杆菌K-12的Gad基因序列设计引物F、R，以大肠杆菌的基因组DNA为模板扩增Gad基因，凝胶电泳条带约为2000 bp，与色氨酸合成酶原基因大小一致；将PCR产物进行纯化，连接到pET28a载体上，得到重组质粒Gad-pET28a，菌落PCR验证后送测序，测序结果表明谷氨酸脱羧酶基因成功插入至载体pET28a；

所述引物F序列（5’-3’）为atgcaccatcatcatcatcatatggataagaagcaagtaacgga；

所述引物R序列（5’-3’）为ctcgagaattgtgagcgctttagtgatcgctgagatatttcaggga；

2）、制备谷氨酸脱羧酶全细胞

将1）中构建的重组质粒Gad-Pet28a转化大肠杆菌BL21(DE3)，得到能表达谷氨酸脱羧酶的Gad-Pet28a大肠杆菌工程菌株，将工程菌株接种到含有50 mg/L的卡那霉素的SOB液体培养基中，接种比例为10%，接种后于37 ℃、200 rpm的摇床上摇瓶培养，当菌体OD₆₀₀达到0.6时，转接至含有2L SOB培养基的5L发酵罐中继续培养，反应前期发酵温度为37 ℃，后期产酶温度为25 ℃，搅拌转速为400 rpm，通气比及罐压分别为2 VVM（立方米/（立方米*分钟））和0.05 MPa；发酵过程中每1小时取样监测菌体量并测定酶活力，待菌体量、酶活力均保持稳定时停止发酵，在温度4 ℃、转速6000 rpm、时间5 min条件下，离心收集谷氨酸脱羧酶全细胞，备用；

3）、用味精制备L-谷氨酸

将10～30 g味精溶解于50～100mL水中，加入10～20 mL浓盐酸，使味精转变成L-谷氨酸，并从水中析出并过滤，将过滤得到的L-谷氨酸用水多次冲洗，至洗下的液体pH大于3时停止冲洗，收集L-谷氨酸，干燥后备用；

4）、制备γ-氨基丁酸

在1 L的反应釜中加入500 mL水，加入谷氨酸脱羧酶全细胞10~70 g/L，加入终浓度0.1~1 mM的磷酸吡哆醛，分三次加入L-谷氨酸100~800 g/L；

第一次加入1/3的L-谷氨酸，在35~40 ℃、220 rpm的条件下反应7小时，用薄层层析检测反应的终点进展，转化率超过98%，停止反应；当底物反应完

后再补加1/3的L-谷氨酸，依次重复完成，再加入剩余的L-谷氨酸，完全反应后，离心收集上清液；

5）、γ-氨基丁酸结晶纯化

将步骤3离心收集的冲洗液80 ℃加热40 min后，离心分离变性蛋白；再80℃蒸发分离后的上清液，待浓缩液体积为原体积的三分之一时，转盛在干净无水的容器中，放置室温，缓慢降温，再置于4 ℃结晶10~15小时，然后抽滤干燥得到γ-氨基丁酸晶体。

2.根据权利要求1所述的一种γ-氨基丁酸的生物制备方法，其特征在于步骤4中所述谷氨酸脱羧酶全细胞的加入量为15~25 g/L。