[发明专利]一类稳定性提高的木聚糖酶突变体及其编码基因和应用

说明书

本发明提供了一类稳定性提高的木聚糖酶突变体及其编码基因和应用，具体是在热多孢菌属Thermopolyspora flexuosa来源的木聚糖酶XYNTH0的基础上通过突变和筛选获得的木聚糖酶突变体XYNTH1、XYNTH2和XYNTH3；相比于未突变的木聚糖酶，本发明得到的木聚糖酶突变体的稳定性和应用效果得到显著提高，有利于其在饲料领域的开发和应用。

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一类稳定性提高的新型木聚糖酶突变体及其编码基因和应用。

背景技术

在养殖行业中，饲料中的木聚糖在动物消化系统中不能被有效的降解，同时还会影响其他营养成分的吸收利用，大大降低了饲料的转化效率。木聚糖酶(xylanase)，通过随机的内切水解木聚糖主链的1，4-β-D-糖苷键，产生木糖或低聚木糖，是木聚糖降解过程中的关键酶。通过在饲料中添加木聚糖酶转化抗营养因子木聚糖对提高饲料转化率非常经济有效。

饲料生产时，酶制剂与饲料混匀后要经过高温造粒，在此过程中酶易变性失活；同时添加在饲料中的酶制剂通常需要在动物消化道内发挥作用，消化道内的蛋白酶对添加的酶制剂有降解作用，而胃液的酸性条件也极易使得酶制剂变性，高温、胃酸和蛋白酶对酶制剂的破坏作用极大的影响了酶制剂在饲料中的添加效果。

目前市场上大多数木聚糖酶最适温度在40～70℃之间，最适pH在5.0-7.0之间，在经过高温或在消化道中极易失活，解决这类问题的一种方法是利用包被剂和载体来提高酶的稳定性，这不但会增加酶制剂的生产成本，而且会严重影响酶制剂的生物利用率；另一种经济有效的方法就是通过改良酶的基因提高其稳定性。从酶的基因和结构入手，筛选得到适宜耐热、耐酸、耐内源蛋白酶的木聚糖酶对降低目前饲用木聚糖酶的生产成本，提高其利用效率具有重要的意义。

易错PCR技术是通过PCR反应扩增目的片段时，通过调整反应条件增加扩增时的突变频率，从而向目的基因中引入随机突变，构建突变体库，从而筛选需要的正向突变体。易错PCR技术可以很好地应用于蛋白质的分子改造中。

发明内容

本发明提供了一类优化的木聚糖酶突变体及其编码基因和应用，通过人工基因突变和大量筛选的方法，对木聚糖酶(GenbankID：CAD48747.1)进行改良，筛选得到耐热性提高的突变体，并将该突变体基因转化到毕赤酵母中，构建得到重组木聚糖酶表达菌株。经验证所述重组木聚糖酶的耐热性以及在胃酸胃液中的稳定性均有所提高，从而有利于提高其在饲料工业中的应用效果。

为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

本发明提供了一种木聚糖酶突变体XYNTH1，所述XYNTH1的氨基酸序列如SEQ IDNO：3所示，XYNTH1是由氨基酸序列为SEQ ID NO：1的木聚糖酶XYNTH0第66位氨基酸由丝氨酸突变为苏氨酸得到。

本发明提供了所述的木聚糖酶突变体XYNTH1的编码基因，其核苷酸序列如SEQ IDNO：4所示。

本发明提供了一种木聚糖酶突变体XYNTH2，所述XYNTH2的氨基酸序列如SEQ IDNO：5所示，XYNTH2是由氨基酸序列为SEQ ID NO：1的木聚糖酶XYNTH0第183位氨基酸由丝氨酸突变为天冬酰胺得到。

本发明提供了所述的木聚糖酶突变体XYNTH2的编码基因，其核苷酸序列如SEQ IDNO：6所示。

本发明提供了一种木聚糖酶突变体XYNTH3，所述XYNTH3的氨基酸序列如SEQ IDNO：7所示，XYNTH3是由氨基酸序列为SEQ ID NO：1的木聚糖酶XYNTH0第66位氨基酸由丝氨酸突变为苏氨酸，同时第183位氨基酸由丝氨酸突变为天冬酰胺得到。

本发明提供了所述的木聚糖酶突变体XYNTH3的编码基因，其核苷酸序列如SEQ IDNO：8所示。