[发明专利]一种囊尾蚴体外培养方法

说明书

本发明提供一种囊尾蚴体外培养方法，特别是一种豆状囊尾蚴离体培养方法。本发明的方法是：从宿主动物体内分离完整的囊尾蚴清洗干净后，转入其内加有培养液的培养容器内，培养容器置于二氧化碳细胞培养箱内，在温度37℃、CO₂浓度5％、相对湿度70％条件下进行培养，虫体开始培养后的第6h及第12h各换液1次，每次换液时尽量除去陈旧培养液，加入新鲜的完全培养液8ml/瓶/次，以后每48h换液1次。本发明有效解决了豆状囊尾蚴离体长时间存活的问题，可以便捷地获得充足的研究材料，虫体体外存活时间长，可满足药物筛选及药理评价的筛选周期，同时可直接观察虫体‑药物作用。本发明的培养不依赖于宿主，实验背景易于控制，可对幼虫阶段具体实验做出较正确的评估。

技术领域

本发明涉及一种寄生虫体外培养方法，本发明所述的寄生虫培养方法是指囊尾蚴体外培养方法，特别是一种豆状囊尾蚴离体培养方法。

背景技术

囊尾蚴病是一种常见的寄生虫病，其分布范围广泛，严重威胁畜牧业发展和公共卫生安全。其中的豆状囊尾蚴病是由豆状带绦虫的中绦期幼虫-豆状囊尾蚴寄生于兔体内而引起的一种常见寄生虫病。在我国，家兔平均感染率高达 40％，死亡率4.0％～23.69％，严重威胁养兔业的发展。豆状囊尾蚴主要寄生于家兔的肝脏、胃网膜、肠系膜或直肠后壁；大量感染时导致病兔肝脏损害，临床表现消化紊乱、食欲不振、精神沉郁、消瘦、贫血等症状，严重时突然死亡；此外可继发巴氏杆菌病等，导致家兔饲料回报率降低，经济效益下降。

豆状带绦虫生活史复杂，其完整生活史需要转换2个宿主才能完成。成虫通常寄生于犬类小肠内，虫卵在成虫孕节内发育，并随孕节脱落释放到外界环境中，污染食物或水源。虫卵被兔吞食后随血流到达肝脏并移行至大网膜、肠系膜等处发育为感染性豆状囊尾蚴。目前我国对该病的防治仍面临很大的难题，亟需筛选和挖掘特异药物靶标及疫苗候选分子，为该病的有效防控和根治提供新手段。随着寄生虫功能基因组的大规模研究发展，基因功能验证及新型药物分析成为了当前寄生虫研究的瓶颈。在豆状带绦虫研究方面，无有效的稳定细胞系可供利用，也尚未建立可行的体外评价模型。

体外培养是寄生虫学研究中一个极具价值的技术平台，可在直观和可控条件下进行寄生虫抗原、药物作用、免疫效应及寄生虫与宿主相互作用等相关研究。近几十年来，随着培养方法不断改进与提高，通过模仿宿主机体的某些因素与条件进而建立适宜的培养方法，促进了寄生虫人工培养技术研究的发展。然而，寄生虫种类繁多，生活史复杂，无通用培养液或统一培养方法对寄生虫进行体外培养。

相对于原虫、吸虫和线虫，绦虫体外培养技术的研究进展较为缓慢。目前，用于豆状囊尾蚴研究的活虫样本，主要采集于自然或实验感染的家兔，该方法存在如下缺点：

(1)借助犬-兔循环感染保虫方法成本高，工作量大，费事费力，投入人员多；在安全性及经济性方面存在问题。另外，保虫试验周期长，一般需要4个月左右才能完成。

(2)依靠家兔体内囊尾蚴活虫样品不便于在直观或可控条件下进行药物筛选和药效评价等研究。

(3)依靠家兔体内囊尾蚴活虫样品不能随时收集足量的代谢分泌抗原或外泌体。

因此，提供一种可行和稳定的豆状囊尾蚴体外培养方法，可大大缩短科研时间和成本，有助于体外进行抗原收集、药物筛选及药物杀虫效果分析等研究；对于带绦虫的研究及其防治技术研究具有重要的学术价值和应用意义。

发明内容

本发明提供一种有效的囊尾蚴离体培养方法，本发明特别提供一种可实现豆状囊尾蚴离体长时间存活的囊尾蚴培养方法。另外，本发明还提供一种便于进行豆状囊尾蚴代谢分泌抗原制备、外泌体制备、虫体代谢检测、药物筛选等需要的豆状囊尾蚴体外培养方法，利用本发明的方法培养的虫体可有利于进行代谢分泌抗原制备、外泌体制备、虫体代谢检测、药物筛选等。亦可作为研究其他重要绦虫基因功能的替代模型，如猪囊尾蚴病、牛囊尾蚴病等。但体外培养过程仅保持囊尾蚴幼虫形态，不涉及体外培养幼虫发育为成虫。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：