[发明专利]一种多子小瓜虫的传代培养方法

说明书

本发明公开了一种多子小瓜虫的传代培养方法，属于原代细胞培养技术领域。本发明简化了分离病鱼体表滋养体的方法，提高获得样本的效率；采用无菌曝气水和控温的方法优化了多子小瓜虫的培养条件，使得滋养体能在优良的环境中存活并在更短的时间内产生更多的掠食体；将掠食体和健康金鱼在高密度的条件下进行感染，增加了感染的几率以及成功率。利用本发明的培养方法对采集到的多子小瓜虫进行传代培养，可以稳定的将虫株保存10代以上，最长可以保存98天，随时可为实验提供大量的各生活史阶段的寄生虫活体样本，方便多子小瓜虫研究的开展。

技术领域

本发明属于原代细胞培养技术领域，具体涉及一种多子小瓜虫的传代培养方法。

背景技术

多子小瓜虫是一种世界性分布的寄生性纤毛虫，由其引起的“白点病”常导致各种淡水鱼类的大量死亡，严重危害水产养殖。孔雀石绿和亚汞制剂曾被认为是治疗小瓜虫病最有效的药物，然而因为其潜在毒性以及高残留作用，在水产养殖中已被禁止使用。而就目前生产中的常用药物都无法对多子小瓜虫病起到很好的治疗效果，要实现对这种寄生虫病的有效防控，掌握其生活史是首要前提。

多子小瓜虫的生活史主要分为三个阶段：滋养体、包囊以及掠食体。滋养体是在体寄生阶段，靠吞食宿主细胞生长发育成熟后脱离鱼体，在水中自由游泳一段时间后，沉落到水体底部，黏附在基质表面形成包囊。包囊是多子小瓜虫的繁殖阶段，经过一段时间的分裂后，成百上千的掠食体从包囊中分泌出来释放到水中。掠食体侵袭到新的宿主后，进入上皮组织内发育至滋养体。在养殖环境中，一旦出现多子小瓜虫，在很短的时间内几乎所有的鱼类都会被感染上，而在实验室条件下却难以对多子小瓜虫进行稳定的传代培养，细胞无法多次传代，这在一定程度上抑制了对多子小瓜虫生活史及其基础研究的开展。

发明内容

基于上述缺陷，本发明提供一种多子小瓜虫的传代培养方法，该方法可以稳定培养采集到的多子小瓜虫，延长虫株的保存时间。

一种多子小瓜虫的传代培养方法，包括如下步骤：

1)从患病鱼的体表以及鳃中分离出多子小瓜虫的滋养体，用无菌曝气水洗去附着的鱼体黏液后，选取细胞形态好、活力旺盛的滋养体作为原代细胞；

2)将选取的滋养体加入到无菌曝气水中，置于培养箱内，在15-30℃下恒温培养，当培养皿内掠食体全部孵出后，对其进行计数，然后按照掠食体与金鱼的数量比为10000-50000:1的比例将掠食体与健康金鱼在装有曝气水的养殖缸中进行同居感染，感染周期为0.5-3小时；

3)当养殖缸内的金鱼开始分泌大量粘液后，向养殖缸内加水，并充氧，然后将养殖缸置于培养箱内，在15-30℃下恒温培养，每天用重新平衡温度后的无菌曝气水对缸内的养殖水进行更换，及时清理死亡的金鱼，4-5天后，金鱼体表出现大量白点，将感染的金鱼按照步骤一所述方法分离出滋养体，即为第一代传代细胞。

4)将第一代传代细胞按照步骤2)到步骤3)的顺序操作，得到第二代传代细胞，依次类推，得到多代传代细胞。

优选地，步骤2)中所述的培养温度为20-25℃。

优选地，步骤2)所述掠食体与金鱼的数量比为30000:1。

优选地，步骤2)中所述的感染周期为1.5小时。

本发明的有益效果是：

本发明的传代培养方法简化了分离病鱼体表滋养体的方法，提高获得样本的效率；采用无菌曝气水和控温的方法优化了多子小瓜虫的培养条件，使得滋养体能在优良的环境中存活并在更短的时间内产生更多的掠食体；将掠食体和健康金鱼在高密度的条件下进行感染，增加了感染的几率以及成功率。利用本发明的培养方法对采集到的多子小瓜虫进行传代培养，可以稳定的将虫株保存10代以上，最长可以保存98天，随时可为实验提供大量的各生活史阶段的寄生虫活体样本，方便多子小瓜虫研究的开展。

具体实施方式