[发明专利]一种高产透明质酸寡糖的重组枯草芽孢杆菌的构建方法

说明书

本发明公开了一种高产透明质酸寡糖的重组枯草芽孢杆菌的构建方法，属于生物工程技术领域。本发明选择yoyJ‑yoyA、lytH、lytD、lytG、lytC作为整合位点，将途径基因glmM、glmS、glmU、tuaD和水蛭来源的透明质酸水解酶基因H6LHyal整合到枯草芽孢杆菌基因组中，不仅提高了透明质酸寡糖的产量，还提高了生物量、有利于后期进行透明质酸寡糖的分离纯化。在3L发酵罐发酵40h时透明质酸寡糖的产量达36.04g/L。其3L发酵罐水平的透明质酸平均分子量HA Mw约为3.3×10⁴Da。本发明为微生物系统高效发酵制备透明质酸寡糖奠定了基础，适合于工业化生产应用。

技术领域

本发明涉及一种高产透明质酸寡糖的重组枯草芽孢杆菌的构建方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

透明质酸(Hyaluronic acid，简称HA)，又名玻璃酸，是广泛应用于医学、化妆品、食用等领域的黏多糖，HA的生物活性和使用效果由其相对分子量(Mw)直接决定。相比于高分子量的HA(分子量在100万Da以上)，小分子透明质酸，例如：透明质酸寡糖(分子量低于1万)，具有的更重要生理活性与特殊生理功能，透明质酸寡糖能渗入真皮，具有轻微扩张毛细血管，增加血液循环、改善中间代谢、促进皮肤营养吸收作用，具有较强的消皱功能，可增加皮肤弹性，延缓皮肤衰老。另外，透明质酸寡糖还具有促血管生成促创伤愈合、免疫调节活性和抗肿瘤活性等作用，其医药学应用前景广泛。

当前，制备小分子透明质酸的方法主要集中于物理法、化学法、酶解法。物理法包括加热、超声波和射线辐射等，物理法操作过程简单，但效率较低，产品稳定性较差。化学法包括水解和氧化降解两类，易引入化学试剂污染，反应条件复杂，产生大量工业废水。酶解法步骤繁琐，需要先得到HA和透明质酸酶后才能进行酶解，并且所用的透明质酸酶市场价格昂贵。因而，这些方法都不是大量合成透明质酸寡糖的高效经济方法。随着合成生物学、代谢工程和分子生物学领域的重大进展，通过合理设计来增强生产目标代谢物的工程菌株已变得越来越普遍，通过基因工程将工程菌直接发酵生产透明质酸寡糖是一个有效方法。但，现有的用于合成透明质酸寡糖的微生物，生产强度不高(发酵100h产量为19.5g/L)。

发明内容

[技术问题]

本发明要解决的技术问题是在枯草芽孢杆菌中整合表达透明质酸寡糖合成途径的基因，无需诱导，实现从廉价碳源(例如：蔗糖或葡萄糖)一步生产透明质酸寡糖；同时，调控基因表达强度，以提高透明质酸寡糖的产量。

[技术方案]

本发明提供了一种整合表达透明质酸寡糖合成途径的基因的重组枯草芽孢杆菌，所述重组枯草芽孢杆菌在基因组yoyJ-yoyA、lytH、lytD、lytG、lytC位点分别整合了基因glmM、glmS、glmU、tuaD和水蛭来源的透明质酸水解酶基因H6LHyal，均以P₄₃启动子为启动子，同时，表达兽疫链球菌来源和巴斯德杆菌来源的透明质酸合酶HasA，并用基于sRNA介导的枯草芽孢杆菌转录后调控系统bsrE/sr5下调旁路途径基因zwf、pfkA、mnaA、murAA、murAB的表达水平。

在本发明的一种实施方式中，所述重组枯草芽孢杆菌是以枯草芽孢杆菌168为宿主，或者，所述重组枯草芽孢杆菌性状为△lacA::szhasA,△bsrE/sr5::glmM,△lytH::glmS,△lytD::glmU,△lytG::tuaD,△lytC::H6LHyal,△bsrE/sr5::szhasA,zwf-opr,pfkA-opr,mnaA-opr,murAA-opr,murAB-opr含有重组质粒pP₃₈-sr5与pHT01-pmhasA的。

本发明还提供了一种利用所述重组枯草芽孢杆菌生长透明质酸寡糖的方法，是以所述重组枯草芽孢杆菌为生产菌株，利用发酵培养基生产透明质酸寡糖。