[发明专利]一种高产透明质酸寡糖的重组枯草芽孢杆菌的构建方法

权利要求书

1.一种用于生产透明质酸寡糖的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，整合表达了透明质酸寡糖合成途径的基因，所述重组枯草芽孢杆菌在基因组yoyJ-yoyA、lytH、lytD、lytG、lytC位点分别整合了基因glmM、glmS、glmU、tuaD和水蛭来源的透明质酸水解酶基因H6LHyal，均以P₄₃启动子为启动子，同时，表达兽疫链球菌来源和巴斯德杆菌来源的透明质酸合酶HasA，并用基于sRNA介导的枯草芽孢杆菌转录后调控系统bsrE/sr5下调旁路途径基因zwf、pfkA、mnaA、murAA、murAB的表达水平；所述重组枯草芽孢杆菌以枯草芽孢杆菌168为宿主；

所述glmM的序列如SEQ ID NO.2，所述glmS的序列如SEQ ID NO.4所示，所述glmU序列如SEQ ID NO.3所示，所述tuaD序列如SEQ ID NO.1所示，所述H6LHyal序列如SEQ ID NO.7所示，所述巴斯德杆菌来源的透明质酸合酶HasA序列如SEQ ID NO.5所示，所述zwf序列如SEQ ID NO.8所示，所述pfkA序列如SEQ ID NO.9所示，所述mnaA序列如SEQ ID NO.10所示，所述murAA序列如SEQ ID NO.11所示，所述murAB序列如SEQ ID NO.12所示；

以pAOX01为质粒表达兽疫链球菌来源的透明质酸合酶；

以pHT01为质粒表达巴斯德杆菌来源的透明质酸合酶。

2.根据权利要求1所述的一种用于生产透明质酸寡糖的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述透明质酸寡糖的平均分子量为(3～10)×10⁴Da。

3.一种生产透明质酸寡糖的方法，其特征在于，利用权利要求1所述重组枯草芽孢杆菌为生产菌株，利用发酵培养基生产透明质酸寡糖。

4.根据权利要求3所述的一种生产透明质酸寡糖的方法，其特征在于，所述发酵培养基是：葡萄糖80g/L，(NH₄)₂SO₄ 1.5g/L，K₂HPO₄·3H₂O 9.15g/L，KH₂PO₄ 3g/L，柠檬酸三钠·2H₂O 1g/L，酵母提取物10g/L，MgSO₄ 2.0g/L，酪蛋白水解液2.5g/L，谷氨酰胺1.0g/L，谷氨酸1.0g/L，1毫升微量元素溶液，pH 7.0；微量元素溶液组成为：CaCl₂ 2.5g/L，MgCl₂ 2.8g/L，ZnCl₂ 0.046g/L，CuSO₄·5H₂O 0.019g/L，MnCl₂·4H₂O 1.0g/L。

5.根据权利要求4所述的一种生产透明质酸寡糖的方法，其特征在于，将种子培养液接种到发酵培养基中，采用分批补料培养的方式发酵生产透明质酸寡糖。

6.根据权利要求5所述的一种生产透明质酸寡糖的方法，其特征在于，将种子培养液按8～10％接种量接种到发酵培养基中，采用发酵罐分批补料培养的方式发酵生产透明质酸寡糖，发酵温度为37℃下、通气速度为2.0vvm、搅拌速度为500rpm，pH保持pH为7.0，发酵8h时，开始流加葡萄糖至发酵结束，补料速度为5g/(L·h)。

7.根据权利要求3所述的一种生产透明质酸寡糖的方法，其特征在于，所述透明质酸寡糖的平均分子量为(3～10)×10⁴Da。