[发明专利]基于Toehold介导链置换反应引发滚环扩增和FRET检测miRNA的方法

说明书

本公开提供了基于Toehold介导链置换反应引发滚环扩增和FRET检测miRNA的方法，该方法利用toehold介导的链置换反应引发待测miRNA进行滚环扩增反应，利用滚环扩增反应的DNA单链、含有供体荧光基团的DNA单链探针和含有受体荧光基团的DNA单链探针实现荧光共振能量转移的检测。本公开由于采用将TMSD与滚环扩增结合产生的DNA单链能够使使荧光团大量聚集，使得供体荧光基团的荧光强度不仅不会产生衰弱，而且产生了逐渐增强的趋势，从而提高了对于分析待测靶标miRNA的含量的效果。

技术领域

本公开属于分子检测领域，涉及基于Toehold介导链置换反应引发滚环扩增和FRET检测miRNA的方法。

背景技术

这里的陈述仅提供与本发明有关的背景信息，而不必然构成现有技术。

MicroRNAs(miRNAs)是一类由内源基因编码的长度约为22个核苷酸的非编码单链RNA分子，具有在翻译水平或转录后水平调控基因表达的功能。miRNAs的表达异常与多种疾病相关，如癌症、代谢性疾病等。因此miRNAs已经成为重要的早期临床诊断标志物。据本公开发明人所知，目前，定性检测RNA含量的方法主要是聚合酶链反应法(PCR)，检测方法较为单一。

Toehold介导的链置换反应(TMSD)是一种不依赖于酶的由DNA的生物物理学特性驱动的化学反应。随着研究者对TMSD的不断深入，发现它不仅可以作为DNA纳米材料的组装基元，还可以作为生物分子识别元件。与简单的Watson-Crick碱基配对相比，TMSD 可以提高核酸识别的特异性。利用TMSD可以实现对miRNA等核酸及小分子物质进行特异性和灵敏检测。然而，本公开发明人发现，TMSD具有信号输出较低的缺陷，该缺陷不利于将TMSD应用于检测miRNA。

发明内容

为了解决现有技术的不足，本公开先将TMSD与滚环扩增(RCA)结合，然后再采用荧光共振能量转移(FRET)进行检测，不仅可以提高识别miRNA的特异性，还可以放大信号来克服单纯TMSD的缺点。在滚环扩增的产物上连接能够产生FRET的两条荧光探针，可以实现对miRNA的定性检测。可应用于定性检测细胞中的目标miRNA，并分析该目标miRNA 的生理功能。

为了实现上述目的，本公开的技术方案为：

一方面，一种miRNA的检测方法，利用toehold介导的链置换(TMSD)反应引发待测miRNA进行滚环扩增反应，利用滚环扩增反应的DNA单链、含有供体荧光基团的DNA单链探针和含有受体荧光基团的DNA单链探针实现荧光共振能量转移的检测。

荧光共振能量转移的过程为：当一个荧光分子(又称为供体荧光分子)的荧光光谱与另一个荧光分子(又称为受体荧光分子)的激发光谱相重叠时，供体荧光分子的激发能诱发受体分子发出荧光，同时供体荧光分子自身的荧光强度衰减。本公开将先将TMSD与滚环扩增(RCA)结合，然后再与荧光共振能量转移(FRET)结合，发现本公开由于采用将TMSD 与滚环扩增(RCA)结合产生的DNA单链能够使使荧光团大量聚集，使得供体荧光基团的荧光强度不仅不会产生衰弱，而且产生了逐渐增强的趋势，从而提高了对于分析待测靶标 miRNA的含量的效果。

为了便于上述检测方法的实现，另一方面，一种基于Toehold介导链置换反应引发滚环扩增和FRET检测miRNA的引物组，包括哑铃型DNA探针、含有供体荧光基团的DNA单链探针、含有受体荧光基团的DNA单链探针；

所述哑铃型DNA探针为5'端和3'端连接的封闭的单链DNA形成的茎环结构，且所述茎环结构中茎的两端均有一个环，其中一个环含有toehold序列，toehold序列与茎的一条单链直接连接，所述茎的一条单链的序列与toehold序列构成的整体序列能够和待测miRNA配位；

含有供体荧光基团的DNA单链探针和含有受体荧光基团的DNA单链探针均能够与引发待测miRNA滚环扩增反应形成的DNA单链进行配位，使配位后的供体荧光基团和受体荧光基团产生荧光共振能量转移。