[发明专利]基于Toehold介导链置换反应引发滚环扩增和FRET检测miRNA的方法

权利要求书

1.一种基于Toehold介导链置换反应引发滚环扩增和FRET检测miRNA的引物组，其特征是，包括哑铃型DNA探针、含有供体荧光基团的DNA单链探针、含有受体荧光基团的DNA单链探针；

所述哑铃型DNA探针为5'端和3'端连接的封闭的单链DNA形成的茎环结构，且所述茎环结构中茎的两端均有一个环，其中一个环含有toehold序列，toehold序列与茎的一条单链直接连接，所述茎的一条单链的序列与toehold序列构成的整体序列能够和待测miRNA配位；

含有供体荧光基团的DNA单链探针和含有受体荧光基团的DNA单链探针均能够与引发待测miRNA滚环扩增反应形成的DNA单链进行配位，使配位后的供体荧光基团和受体荧光基团产生荧光共振能量转移；

toehold序列长度为具有8个碱基的序列；

所述哑铃型DNA探针从5'端到3'端的DNA序列为：GACAACCTACAAATACTGATGACAATCTATAAGGTTGTCCGTGTTGCAACAGAGAAGACAACACG；

含有受体荧光基团的DNA单链探针的DNA序列为：ATGACAATCTA；

含有供体荧光基团的DNA单链探针的DNA序列为：AGAGAAGACAACACGGACAACCT。

2.如权利要求1所述的引物组，其特征是，所述供体荧光基团为羧基四甲基罗丹明，所述受体荧光基团为6-羧基荧光素。

3.一种miRNA的检测试剂盒，其特征是，包括权利要求1~2任一所述的引物组、DNA聚合酶、DNA聚合酶反应缓冲液、BSA、dNTPs。

4.如权利要求3所述的检测试剂盒，其特征是，所述DNA聚合酶为phi29 DNA聚合酶。

5.一种非疾病诊断目的的基于Toehold介导链置换反应引发滚环扩增和FRET检测miRNA的方法，其特征是，采用权利要求1~2任一所述的引物组或权利要求3~4任一所述的试剂盒，其过程包括：

先向待测中添加哑铃型DNA探针、DNA聚合酶、DNA聚合酶反应缓冲液、dNTPs和水加热至体温下进行反应，反应终止；再添加含有供体荧光基团的DNA单链探针和含有受体荧光基团的DNA单链探针进行反应；然后进行荧光检测。

6.如权利要求5所述的方法，其特征是，反应终止的步骤为：加热至60~70℃反应。

7.如权利要求5所述的方法，其特征是，向链状DNA单链中添加DNA连接酶及DNA连接酶反应缓冲液，在20~25℃进行反应，终止反应后获得哑铃型DNA探针。