[发明专利]基于抗性基因的外源质粒残留的检测试剂盒及其使用方法

说明书

本发明提供了多种引物对组合，包含引物对5和选自引物对1、2、3和4中的任意一个、两个、三个或四个；本发明还提供了探针和探针组合以及包含前述引物对组合和/或探针或探针组合的制剂盒；本发明还提供了一种测定CAR质粒拷贝数的方法和一种对CAR质粒残留进行控制的方法。本发明提供的引物对组合、探针或探针组合或试剂盒操作简便，特异性好，灵敏性高，反应效率高，反应体系重复性好，能够用于含kana抗性基因的CAR质粒拷贝数的定量检测或者CAR‑T细胞回输治疗患者外周血中含有kana抗性基因的CAR质粒残留水平的定量检测。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体的，涉及一种基于抗性基因的外源质粒残留的检测试剂盒及其使用方法。

背景技术

CAR-T细胞技术是通过将识别肿瘤相关抗原的单链抗体(scFv)和胞内信号域“免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)”在体外进行基因重组，生成重组质粒，然后在体外转染天然T细胞，纯化和扩增后的T细胞表达嵌合抗原受体(CAR)，表达CAR的T细胞称为CAR-T细胞。CAR-T细胞能够以抗原依赖、非MHC限制的方式识别的方式结合肿瘤抗原，启动并活化特异性杀伤肿瘤效应。目前，CAR免疫疗法已成为一种新的过继免疫治疗技术，其对许多实体肿瘤、血液肿瘤，尤其是B细胞淋巴瘤治疗效果明显。CAR治疗利用改良的患者的T细胞可以突破MHC限制性直接识别肿瘤抗原，靶向清除恶性肿瘤。CAR-T细胞在血液肿瘤中已经被广泛应用，特别是CD19作为靶抗原的CAR-T细胞免疫治疗已获得突破性进展。

CAR主要由三个部分组成：(1)胞外区：包含靶抗原单克隆抗体单链可变区(ScFv)，可以特异性识别肿瘤细胞表面抗原；(2)跨膜区；(3)胞内区：包含单细胞信号转导区域(CD3)和协同共刺激信号区，前者负责连接胞内信号转导通路和抗原识别受体，激活T细胞，后者可促使CAR-T细胞在体内不断增殖并持续存活，增强抗肿瘤活性。CAR结构已经从第一代CAR仅涉及scFv和CD3δ信号传导结构域的初始组合物演变成其中已经添加协同共刺激信号结构域的更复杂形式，从而产生第二代(例如CD3δ加4-1BB或CD28信号结构域)和第三代(例如，CD3δ加4-1BB和CD28信号传导结构域)CAR，增强了T细胞的持续肿瘤杀伤效应和增殖能力，但这三种CAR-T在注射前需要对患者进行化疗或放疗等预处理，以使抗肿瘤效应达到最佳。第四代CAR-T引入细胞因子和共刺激配体，例如能够分泌IL-12且靶向CD19，在缺乏环磷酰胺预处理情况下仍具有很好的抗CD19+肿瘤细胞作用，到目前为止，已经发展到第五代的通用CAR-T。

目前CAR-T免疫治疗普遍采用慢病毒、mRNA或质粒转染将CAR构建体转染到T细胞中，以将它们导向表面暴露的肿瘤相关抗原(TAA)，如中国专利201610327646.X采用针对CD30的CAR-T技术，公开了一种靶向CD30的复制缺陷型重组慢病毒的CAR-T转基因载体，但大多慢病毒感染方法修饰基因插入位点不明确，感染效率受限，整个过程复杂难操作且周期长，且有潜在的致瘤风险。而我们采用质粒载体导入CAR系统(CN 20150638974.7)虽然较大的提高了转导效率且缩短了转导周期，但是会有部分质粒残留在T细胞内，可能会对后续的治疗效果产生未知的影响。kana抗性基因是CAR质粒中常见的用于筛选阳性克隆的抗性基因，利用实时荧光定量PCR的方法，可以从分子水平对kana抗性基因含量进行检测，以计算单次回输细胞中的质粒残留水平。

因此，目前亟需建立检测kana抗性基因特别是包含kana抗性基因的CAR质粒基因的检测方法。

发明内容

本发明人经过深入的研究和创造性的劳动，得到了多组引物对和探针。在此基础上，本发明人得到了荧光定量PCR测定kana抗性基因拷贝数的方法和试剂盒。本发明的方法或试剂盒能够测定含有kana抗性基因的CAR质粒残留在细胞内的拷贝数，用于计算单次回输细胞中的质粒残留水平。

由此提供了下述发明：

本发明的一个方面涉及引物对组合，其包含下述引物对中的引物对5和引物对1、2、3和4中的任意一个、两个、三个或四个：