[发明专利]基于抗性基因的外源质粒残留的检测试剂盒及其使用方法

权利要求书

1.引物对组合，其包含以下引物对中的引物对5和选自引物对1、2、3和4中的任意一个、两个、三个或四个：

引物对1，SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的引物对；

引物对2，SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的引物对；

引物对3，SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的引物对；

引物对4，SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示的引物对；

引物对5，SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11所示的引物对。

2.探针或探针组合，其包含以下探针中的任意一个或两个：

探针A，其核酸序列如SEQ ID NO:13所示；和

探针B，其核酸序列如SEQ ID NO:12所示。

3.根据权利要求2所述的探针或探针组合，其中，所述探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团；优选地，所述荧光报告基团选自FAM、Hex、VIC、ROX和Cy5；更优选地，所述荧光淬灭基团选自BHQ1、TAMRA、JOE、BHQ2和MGB。

4.根据权利要求2或3所述的探针或探针组合，其中，

探针A中的一个或多个位置的碱基被锁核酸修饰；探针B不被锁核酸修饰。

5.根据权利要求4所述的探针或探针组合，其中，

探针A的5’端起第4位和第7位中的任意1个或2个碱基被锁核酸修饰。

6.一种试剂盒，其包含权利要求1所述的引物对组合，和/或权利要求2至5中任一权利要求所述的探针或探针组合。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，其还包含PCR反应所需的试剂，优选地，所述PCR反应所需的试剂选自Mg²⁺、反应缓冲液、dNTP和DNA聚合酶中的一种或多种。

8.一种测定CAR-T细胞治疗残留质粒拷贝数的方法，包括如下步骤：

(1)提取待测样品的DNA；

(2)使用含kana抗性基因的CAR质粒和含Actin基因的质粒作为标准品母液，分别制成kana抗性基因标准品系列和Actin标准品系列；

(3)使用权利要求1的引物对组合和/或权利要求2-5所述的探针或探针组合和/或权利要求6-7所述的试剂盒，分别对含kana抗性基因CAR质粒标准品系列、Actin标准品系列和待测样品的DNA进行实时荧光定量PCR；

(4)根据每个含kana抗性基因CAR质粒标准品系列产生的Ct值与对应拷贝数，含Actin标准品系列产生的Ct值与对应拷贝数，分别绘制标准曲线，获得计算公式；

(5)将待测样品的kana抗性基因和Actin基因的Ct值带入步骤(4)中的标准曲线的计算公式，获得待测样品的kana抗性基因拷贝数和Actin拷贝数；

优选地，步骤(1)中的待测样品为含kana抗性基因CAR质粒转导过的细胞；

优选地，步骤(2)中的梯度稀释为10倍梯度稀释；

优选地，步骤(3)中所述实时荧光定量PCR的扩增反应的条件为：94℃5min；94℃20s，60℃1min，共40个循环。

9.一种对CAR质粒残留量进行检测的方法，包括下述步骤：

A.测定kana抗性基因的拷贝数，

B.评估质粒残留量或与免疫治疗要求的残留外源基因拷贝数进行比较；

其中，步骤A中所述测定kana抗性基因拷贝数采用根据权利要求8所述的测定kana抗性基因拷贝数的方法；

优选地，所述CAR质粒含有kana抗性基因。

10.权利要求1所述的引物对组合和/或权利要求2至5中任一权利要求所述的探针或探针组合在制备用于测定CAR质粒拷贝数的试剂或制备用于对CAR质粒残留进行质量控制的试剂中的用途；

优选的，所述CAR质粒含有kana抗性基因。