[发明专利]快速检测沙眼衣原体双重qPCR方法及引物和探针

说明书

本发明提供了一种快速检测沙眼衣原体双重qPCR方法及引物和探针，包括如下步骤：(1)前期准备程序；(2)核酸提取与纯化；(3)引物/探针设计、合成、标记；(4)qPCR扩增及结果判断；(5)检测下限及扩增线性范围试验；(6)诊断灵敏度、特异性计算；(7)统计方法；本发明的有益效果在于：检测下限低至2copies/PCR，扩增线性范围均达到1.0×102‑1.0×108copies/mL，对沙眼衣原体的诊断灵敏度和特异性分别为100.0％(134/134)，99.3％(1142/1150)，从样品处理到报告结果≤2.0小时；本方法专利简便、快速、灵敏度高、特异性好，不仅可提高沙眼衣原体感染的诊断能力，还可实现快速检测，为尽早精准治疗赢得时间。

【技术领域】

本发明涉及一种沙眼衣原体双重qPCR方法，尤其涉及一种快速检测沙眼衣原体双重qPCR方法及引物和探针。

【背景技术】

沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis,CT)是一种专性胞内寄生病原，不同的血清型可以造成不同的疾病和并发症，包括生殖道感染(血清型D-K)，沙眼(血清型A-C)和性病淋巴肉芽肿(血清型L1-L3)[1-3]。作为最常见的性传播病原，沙眼衣原体可以引起严重的盆腔炎、异位妊娠和输卵管性不孕[4]，给家庭和社会带来巨大的压力和医疗消耗。每年全球范围内新增沙眼衣原体泌尿生殖道感染病例约9200万例，大约50％的男性感染者和70％的女性感染者不表现出临床症状，造成大量的沙眼衣原体感染者得不及时诊断和正规治疗[5]，从而成为传染源继续传播疾病。

细胞培养因其良好的特异性而被认为是沙眼衣原体检测的金标准[6]。但由于其成本高、耗时长、技术难度大、灵敏度低，已不再作为沙眼衣原体的常规检测手段[7]。目前许多替代的血清学技术，如酶联免疫吸附试验(ELISA)和免疫胶体金技术(ICGT)可以大大缩短检测时间，但不适用于诊断急性CT感染[8]。核酸扩增试验(NAATs)以其高灵敏度、高特异性和快速的特点成为临床微生物实验室最推荐的沙眼衣原体感染诊断方法[9,10]。事实上，实时荧光定量PCR(quantitative Real-time PCR，qPCR)和多重qPCR(multiplex qPCR)等现代PCR技术的出现可以将报告时间缩短至2小时内[11,12]。然而，真正可以用于沙眼衣原体检测的具有高灵敏度和高特异性的qPCR方法仍然缺乏，这造成了沙眼衣原体感染的漏诊和误诊。

【发明内容】

本发明目的在于解决沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis,CT)是一种专性胞内寄生病原，不同的血清型可以造成不同的疾病和并发症，包括生殖道感染(血清型D-K)，沙眼(血清型A-C)和性病淋巴肉芽肿(血清型L1-L3)[1-3]。作为最常见的性传播病原，沙眼衣原体可以引起严重的盆腔炎、异位妊娠和输卵管性不孕[4]，给家庭和社会带来巨大的压力和医疗消耗，在精准医学日益发展的当下，现有发明或试剂已无法满足需求而提供的一种能实现精准诊断并适合我国人群的快速检测沙眼衣原体双重qPCR方法及引物和探针。

本发明是通过以下技术方案来实现的：一种快速检测沙眼衣原体双重qPCR方法，包括如下步骤：

(1)前期准备程序：

研究样本：随机留取性传播疾病患者的泌尿生殖道标本若干份，包括男性尿道拭子若干份、女性宫颈内拭子和阴道拭子若干份，用于方法评价。

仪器与试剂：

①核酸提取仪(ExPure20)及其配套磁珠法提取纯化试剂；

②荧光定量PCR仪(LightCycler480)；多重荧光定量PCR体系(Platinum^TMMultiplex PCR Master Mix)；

③PCR产物测序；

(2)核酸提取与纯化：