[发明专利]一种间充质干细胞人工胰岛的制备方法

说明书

本发明涉及生物医学领域，具体涉及一种间充质干细胞人工胰岛的制备方法。一种间充质干细胞人工胰岛的制备方法，包括以下步骤：(1)间充质干细胞培养并诱导生成胰岛样细胞；(2)血管内皮细胞的提取与培养；(3)温敏性壳聚糖水凝胶的制备；(4)制备复合型水凝胶；(5)将步骤(4)得到的复合型水凝胶，进行局部移植后，在37℃体温环境下迅速发生凝集，形成人工胰岛。本发明公开的一种间充质干细胞人工胰岛的制备方法解决了胰岛素治疗过程中所出现的胰岛素抵抗、胰岛移植时所需胰岛数目较多和较强免疫排斥反应的问题，从而为治疗I型糖尿病进行胰岛移植提供了新的供体。

技术领域

本发明涉及生物医学领域，具体涉及一种间充质干细胞人工胰岛的制备方法。

背景技术

糖尿病(DM,Diabetes Mellitus)是胰岛素分泌相对或绝对不足或胰岛素受体缺陷而引起的糖、脂肪和蛋白质代谢紊乱性疾病。糖尿病是一种内分泌疾病，具有严重的并发症，极大程度地危害着人类健康。

I型糖尿病是指胰岛β细胞破坏导致胰岛素绝对缺乏。目前治疗I型糖尿病有胰岛素注射和胰岛移植两种方法，但都具有局限性。注射胰岛素，是减轻糖尿病症状最有效的手段。但病人在注射一段时间胰岛素后，会产生胰岛素抵抗。机体会产生胰岛素抗体，导致胰岛素的生物活性大大丧失。而对于病情较为严重的糖尿病患者和胰腺摘除的患者，胰岛移植是他们首选的治疗方式。但胰岛移植时所需胰岛数目过多，并且移植后免疫排斥反应较大，成为治疗I型糖尿病的困扰。为此，我们发明了一种间充质干细胞人工胰岛的制备方法，解决了胰岛素治疗过程中所出现的胰岛素抵抗、胰岛移植时所需胰岛数目较多和较强免疫排斥反应的问题，从而为治疗I型糖尿病进行胰岛移植提供了新的供体。

发明内容

发明目的：本发明针对上述现有技术存在的问题做出改进，即本发明公开了一种间充质干细胞人工胰岛的制备方法。本发明使用复合有间充质干细胞诱导的胰岛样细胞和血管内皮细胞的壳聚糖水凝胶，制备成人工胰岛，为解决糖尿病治疗过程中所出现的胰岛素抵抗、胰岛移植时所需胰岛数目较多和较强免疫排斥反应的问题，并且加入血管内皮细胞可加快人工胰岛血管化，使胰岛样细胞更好地生存，有利于延长治疗时间。

技术方案：一种间充质干细胞人工胰岛的制备方法，包括以下步骤：

(1)间充质干细胞培养并诱导生成胰岛样细胞；

(2)血管内皮细胞的提取与培养；

(3)温敏性壳聚糖水凝胶的制备；

(4)制备复合型水凝胶；

(5)将步骤(4)得到的复合型水凝胶，进行局部移植后，在37℃体温环境下迅速发生凝集，形成人工胰岛。

进一步地，步骤(1)中的间充质干细胞为脐带间充质干细胞，其包括：

(11)脐带间充质干细胞的提取

(111)无菌条件下，取健康的脐带标本10～20cm，置于1％含双抗的PBS缓冲液中；

(112)在超净工作台中，反复用PBS冲洗脐带标本以去除残留血液；

(113)在培养皿中剥离脐带标本的外膜、脐静脉和脐动脉后，将剩余组织块剪碎至体积小于1mm³，然后放入含有DMEM/F12完全培养基的细胞培养皿中，置37℃、5％v/v％CO₂、饱和湿度培养箱中培养，4d后进行半量换液，待发现有细胞爬出后，每3d进行换液一次，传至第3代，待第3代脐带间充质干细胞达到80％～90％融合时，用0.25wt％胰酶溶液消化细胞，DMEM/F12完全培养基终止消化，轻轻吹打皿底并收集细胞，1000rpm离心5分钟，弃去上清，向细胞沉淀中加入DMEM/F12完全培养基1ml,重悬细胞沉淀，并对其进行细胞计数，完成后即得到第3代的脐带间充质干细胞悬液，其中：