[发明专利]一种间充质干细胞人工胰岛的制备方法

权利要求书

1.一种间充质干细胞人工胰岛的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)间充质干细胞培养并诱导生成胰岛样细胞；

(2)血管内皮细胞的提取与培养；

(3)温敏性壳聚糖水凝胶的制备；

(4)制备复合型水凝胶；

(5)将步骤(4)得到的复合型水凝胶，进行局部移植后，在37℃体温环境下迅速发生凝集，形成人工胰岛。

2.如权利要求1所述的一种间充质干细胞人工胰岛的制备方法，其特征在于，步骤(1)中的间充质干细胞为脐带间充质干细胞，其包括：

(11)脐带间充质干细胞的提取

(111)无菌条件下，取健康的脐带标本10～20cm，置于1％含双抗的PBS缓冲液中；

(112)在超净工作台中，反复用PBS冲洗脐带标本以去除残留血液；

(113)在培养皿中剥离脐带标本的外膜、脐静脉和脐动脉后，将剩余组织块剪碎至体积小于1mm³，然后放入含有DMEM/F12完全培养基的细胞培养皿中，置37℃、5％v/v％CO₂、饱和湿度培养箱中培养，4d后进行半量换液，待发现有细胞爬出后，每3d进行换液一次，传至第3代，待第3代脐带间充质干细胞达到80％～90％融合时，用0.25wt％胰酶溶液消化细胞，DMEM/F12完全培养基终止消化，轻轻吹打皿底并收集细胞，1000rpm离心5分钟，弃去上清，向细胞沉淀中加入DMEM/F12完全培养基1ml,重悬细胞沉淀，并对其进行细胞计数，完成后即得到第3代的脐带间充质干细胞悬液，其中：

DMEM/F12完全培养基包括10v/v％FBS、1v/v％青链霉素，余量为DMEM/F12；

脐带间充质干细胞传代方法为：待脐带间充质干细胞达到80％～90％融合时，用0.25wt％胰酶溶液消化细胞，DMEM/F12完全培养基终止消化，轻轻吹打皿底并收集细胞，1000rpm离心5分钟，按1：2～3的比例传代；

(12)间充质干细胞诱导胰岛样细胞

(121)取步骤(113)得到的第3代的脐带间充质干细胞悬液，接种于六孔板中，每孔细胞悬液浓度为2×10⁵个/ml，加入10v/v％FBS、1v/v％青链霉素的DMEM/F12完全培养基进行培养，待脐带间充质干细胞融合至70％～80％后，更换培养基，加入第一诱导培养基进行诱导分化，共诱导10～14d，其中：

第一诱导培养基含有10～15v/v％FBS、50～150μg/Lβ-神经生长因子、4～20mmol/L尼克酰胺和10～40μg/L表皮生长因子，余量为DMEM/F12；

(122)将步骤(121)诱导的脐带间充质干细胞继续进行诱导，更换培养基，加入第二诱导培养基诱导培养12～16d，形成胰岛样细胞团，其中：

第二诱导培养基含有5～20mmol/L尼克酰胺、5～15μg/L碱性成纤维细胞生长因子、2～8nmol/L活化素A和1.0～2.0v/v％胰岛素-转铁蛋白-硒，余量为DMEM/F12。