[发明专利]一种DNA阻断序列组合物及其制备方法和检测系统及检测方法

说明书

本发明公开一种DNA阻断序列组合物及其制备方法和检测系统及检测方法，属于生物技术领域。阻断序列组合物包括阻断序列A和阻断序列B，阻断序列A和阻断序列B可分别与目标DNA序列的正义链和反义链结合。两种阻断DNA序列均包括，单链toehold序列部分、双链主反应部分和发卡序列。本发明设计简单，仅根据目标位点所在序列的野生型序列信息进行设计，无需预先知道变异位点的具体位置和类型。且，独立性好，相互之间无相互作用发生，不会产生其他副产物。该阻断序列基于DNA链置换的反应原理，可特异性阻断目标序列的扩增。且对PCR退火温度要求不高，均有利于推广用于多重目标片段的Block PCR反应。本发明的封闭效果特异性好，可结合测序实现样本中0.1％SNP的富集检出。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种DNA阻断序列组合物及其制备方法，和检测系统、检测方法。

背景技术

在目前的分子诊断中，DNA序列变异是一种非常有价值的分子标志物。可应用领域主要包括液体活检、产前诊断、感染性疾病、器官移植以及法医学。统计结果显示，截止到2018年，全球估计有1819万癌症新增病例以及960万癌症死亡病例。我国癌症患病率在国际上位于中等偏上水平，每天约有1万人确诊癌症，相当于平均每分钟就有7个人得癌症。现有研究表明，携带疾病信息的单碱基变异，尤其是低频突变位点的检测在癌症液体活检中是有重要意义的。例如，循环肿瘤DNA稀有突变位点的检测有助于癌症的早期检测、药物抗性的动态监测、发现微小残留病灶等。ddPCR和ARMS技术因其检测灵敏度高，已广泛用在已知变异位点检测中，然而这两种方法都需要针对特定已知类型的位点进行设计，应用通量低，不适用于未知位点的检测和复杂多样的临床应用。Sanger测序因其准确、稳定，价格低廉的特征，目前仍广泛应用，然而，这种方法只能用于检测SNP比例大于20％的样本。高通量二代测序技术(Next-generation sequence，NGS)已广泛应用于DNA序列分析中。在NGS相关应用研究中，为了减少测序成本，通常在测序文库构建过程中结合多重PCR和DNA杂交的方法进行靶向富集。在对目标片段进行富集过程中，携带突变位点的DNA序列和正常野生型DNA序列会统一被富集到测序文库中，携带变异位点的DNA序列仍然会淹没在正常野生型DNA序列的海洋中。在现在的标准操作流程下，二代测序技术尚不能精准识别低于2％的DNA单碱基变异，基于NGS的DNA低频突变位点的准确、灵敏地检测仍然存在很大的挑战性。尽管DNA序列精确度可以通过分子条形码和高深度测序实现，但是这些方法都需要对每个DNA分子进行大量读出，野生型序列消耗了大量的试剂和序列读出能力，造成数据量大，分析困难，超深度测序可以提供更多有意义的DNA稀有变异的序列信息，然而这种方法的高额费用，阻碍了广泛临床应用。

随着高通量测序技术的发展和广泛应用，迫切需要研究用于移除高丰度野生型DNA序列的方法，用于测序之前，对未知位点和类型的突变DNA序列(尤其是低频突变位点)进行负向富集。此类方法，通常通过对野生型序列进行选择性封闭，实现对未知突变位点序列的选择性扩增。现有已报道的DNA封闭探针包括普通DNA序列、PNA、LNA。这些特异性封闭方法的实现依赖于封闭探针与正常序列和野生型序列形成双链结构的差异性Tm值，因此对每个反应的温度控制要求非常严格。Tm值依赖的PCR反应，仅仅适用于同时富集单个或者限制数量的目标分子。对探针合成技术要求高，限制了在高通量测序技术应用过程中的广泛应用。

发明内容

本发明实施例提供了一种DNA阻断序列组合物及其制备方法，检测系统及检测方法，结合sanger测序，实现了对样本中低达0.1％的变异基因序列的检出。为了对披露的实施例的一些方面有一个基本的理解，下面给出了简单的概括。该概括部分不是泛泛评述，也不是要确定关键/重要组成元素或描绘这些实施例的保护范围。其唯一目的是用简单的形式呈现一些概念，以此作为后面的详细说明的序言。

根据本发明实施例的第一方面，提供了一种DNA阻断序列组合物，包括，阻断序列A和阻断序列B；其中，所述阻断序列A可与目标DNA序列的正义链结合，所述阻断序列B可与目标DNA序列的反义链结合；且，所述阻断序列A和所述阻断序列B均包括：