[发明专利]一种合成乳酰-N-新四糖的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用

说明书

本发明公开了一种合成乳酰‑N‑新四糖产量的重组枯草芽孢杆菌，所述重组枯草芽孢杆菌是通过在宿主菌Bacillus subtilis 168△amyE:P₄₃‑lacY，P₄₃‑lgtB，P_xylA‑comK的基因组上整合两个β‑1,4‑半乳糖转移酶基因，并外源表达β‑1,3‑N‑葡糖氨基转移酶基因得到的。本发明的重组枯草芽孢杆菌与改造前菌株相比，其合成乳酰‑N‑新四糖的产量从720mg/L提高到1300mg/L，为进一步代谢工程改造枯草芽孢杆菌生产乳酰‑N‑新四糖奠定了基础。

技术领域

本发明属于遗传工程的技术领域，具体涉及一种合成乳酰-N-新四糖的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用。

背景技术

母乳是婴儿天然和理想的食品。母乳中，除了婴儿成长和发育所需的营养素，它还含有数千种具有生物活性的物质。人乳低寡糖(Human Milk Oligosaccharides HMOs)在母乳中的含量大约在5-15g/L，是母乳中最重要的双歧因子。乳酰-N-新四糖(LNnT)是其中重要的组成成分，同时也是其他复杂母乳寡糖的核心结构元件，例如岩藻糖基化，唾液酸化的寡糖。由于乳酰-N-新四糖及其衍生物具有促进细胞分化、提高肠道上皮细胞免疫调节功能、增加肠道益生菌的相对丰度等重要生理功能，因此，合成乳酰-N-新四糖具有重要的意义。采用生物合成技术中的代谢工程的手段在枯草芽孢杆菌中构建高效合成系统，不仅可以通过工业化大量生产LNnT以满足需求量，同时构建了食品级安全菌株枯草芽孢杆菌产母乳寡糖的底盘细胞，为后期在枯草芽孢杆菌中合成其他母乳寡糖提供支持。

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是GRAS(generally regard as safe)菌株，遗传背景清晰，易于进行异源基因表达，培养周期短和不产生内毒素。因此，运用代谢工程手段构建枯草芽孢杆菌工程菌是生产乳酰-N-新四糖的有效策略。但是由于合成途径中存在关键酶的活力不足，限制最终产量的合成。如何提高关键酶的催化活力，解除限制因素，是亟需解决的问题。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种合成乳酰-N-新四糖的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用。

具体的，第一方面，本发明提供了一种合成乳酰-N-新四糖产量的重组枯草芽孢杆菌。所述重组枯草芽孢杆菌是通过在宿主菌Bacillus subtilis 168△amyE:P₄₃-lacY，P₄₃-lgtB，P_xylA-comK的基因组上整合两个β-1,4-半乳糖转移酶基因，并外源表达β-1,3-N-葡糖氨基转移酶基因得到的。

本发明通过在基因组中增加两个β-1,4-半乳糖转移酶基因的拷贝数，增加β-1,4-半乳糖转移酶的表达量，从而提高酶活，加快前体的转化，使乳酰-N-新四糖的产量明显提高。

需要进一步说明的，所述宿主菌是以枯草芽孢杆菌168为出发菌株，通过以启动子P_xylA调控基因comK的表达，乳糖透性酶编码基因整合到基因组amyE位点，β-1,4-半乳糖转移酶编码基因整合到基因组ydeS位点和ydzO位点中间得到的。

第二方面，本发明还提供了所述的合成乳酰-N-新四糖的重组枯草芽孢杆菌的构建方法，该构建方法包括以下步骤：

(1)通过融合PCR构建包含ydaH，ydzA基因同源臂、β-1,4-半乳糖转移酶基因、P₄₃启动子、博来霉素抗性基因序列的重组片段；

(2)通过融合PCR构建包含yszA，ysxE基因同源臂、β-1,4-半乳糖转移酶基因、P₄₃启动子、氯霉素抗性基因序列的重组片段；