[发明专利]一种合成乳酰-N-新四糖的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用有效
| 申请号： | 201910146431.1 | 申请日： | 2019-02-27 |
| 公开（公告）号： | CN109735480B | 公开（公告）日： | 2021-11-12 |
| 发明（设计）人： | 刘龙;董晓敏;吕雪芹;李江华;堵国成;陈坚 | 申请（专利权）人： | 光明乳业股份有限公司 |
| 主分类号： | C12N1/21 | 分类号： | C12N1/21;C12N15/90;C12P19/26;C12R1/125 |
| 代理公司： | 北京东正专利代理事务所(普通合伙) 11312 | 代理人： | 蔡仲德 |
| 地址： | 201103 *** | 国省代码： | 上海;31 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 合成 新四糖 重组 枯草 芽孢 杆菌 及其 构建 方法 应用 | ||
1.一种合成乳酰-N-新四糖的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述重组枯草芽孢杆菌是通过在宿主菌Bacillus subtilis 168△amyE:P43-lacY，P43-lgtB，PxylA-comK的基因组上整合两个β-1,4-半乳糖转移酶基因，并外源表达β-1,3-N-葡糖氨基转移酶基因得到的。
2.根据权利要求1所述的合成乳酰-N-新四糖的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述宿主菌是以枯草芽孢杆菌168为出发菌株，通过以启动子PxylA调控基因comK的表达，乳糖透性酶编码基因整合到基因组amyE位点，β-1,4-半乳糖转移酶编码基因整合到基因组ydeS位点和ydzO位点中间得到的。
3.权利要求1所述的合成乳酰-N-新四糖的重组枯草芽孢杆菌的构建方法，其特征在于，该构建方法包括以下步骤：
(1)通过融合PCR构建P43控制表达的β-1,4-半乳糖转移酶基因，其中融合片段设计的顺序依次是，ydaH基因左同源臂片段、博来霉素抗性基因片段、P43启动子片段、β-1,4-半乳糖转移酶基因片段以及ydzA基因右同源臂片段，这5个片段按顺序组装获得重组片段，序列如SEQ ID NO.47所示；
(2)通过融合PCR构建P43控制表达的β-1,4-半乳糖转移酶基因，其中融合片段设计的顺序依次是，yszA基因左同源臂片段、氯霉素抗性基因片段、P43启动子片段、β-1,4-半乳糖转移酶基因片段以及ysxE基因右同源臂片段，这5个片段按顺序组装获得重组片段，序列如SEQ ID NO.58所示；
(3)将步骤(1)构建的重组片段转化Bacillus subtilis 168△amyE:P43-lacY，P43-lgtB，PxylA-comK，通过验证获得重组枯草芽孢杆菌BY03a；
(4)将步骤(2)构建的重组片段转化步骤(3)的重组枯草芽孢杆菌BY03a，通过验证获得重组枯草芽孢杆菌BY03b；
(5)将pP43NMK-lgtA转化重组枯草芽孢杆菌BY03b，得到合成乳酰-N-新四糖的重组枯草芽孢杆菌BY05。
4.权利要求1所述的重组枯草芽孢杆菌在发酵生产乳酰-N-新四糖中的应用。
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