[发明专利]一种PD-L1外泌体的磁免疫化学发光检测方法

说明书

本发明公开了一种PD‑L1外泌体的磁免疫化学发光检测方法，属于体外快速检测技术领域。检测所用试剂盒含有抗体A、抗体B、多孔泡沫金属填充的中空柱和磁铁，所述抗体A为化学发光分子或能使底物发光的酶标记的外泌体抗体，所述抗体B为磁珠标记的外泌体抗体；所述抗体A和抗体B中至少有一种为外泌体PD‑L1抗体。检测方法为先将抗体A、抗体B与样品孵育，然后借助多孔泡沫金属磁吸实现高效捕获分离，清洗杂质后，撤去磁场，收集双抗夹心复合物并检测。此方法集成样品孵育，磁吸高效捕获分离以及快速检测，具有操作方便，检测快捷，以及成本低等特点。

技术领域

本发明属于体外快速检测技术领域，具体涉及一种PD-L1外泌体的磁免疫化学发光检测试剂盒和检测方法。

背景技术

外泌体是细胞分泌到胞外微环境中的纳米级小囊泡(直径50-150nm)，在1983首次被发现。但由于分析手段的缺乏，长期以来外泌体被认为是细胞排泄胞内垃圾的工具。随着分析方法的不断创新，外泌体分泌的机制逐渐被揭示。现在，科学界主流的观点认为，外泌体主要参与细胞间的信号传递以及作为疾病标记物。2013年诺贝尔生理医学奖授予了揭示这一领域重大发现的三位杰出科学家。然而，由此引发的外泌体功能研究与未来潜在应用给国际学术界带来无限遐想。2015年，借助活体成像技术，外泌体等胞外膜泡在体内广泛传递获得证实；而更激动人心的发现，外泌体正颠覆科学界对癌症发育的认知：传统观点认为，肿瘤转移是由于原发灶肿瘤细胞通过血液循环系统直接落户到其他组织。这导致了时下循环肿瘤细胞研究盛况空前；在正常情况下，T细胞鉴别到癌细胞后使癌细胞自动裂解，维持人体的平衡。但是癌细胞表面表达一种特殊的蛋白质(受体)，和T细胞结合，令T细胞产生“错觉”，认为癌细胞是“无害的”，同时使得T细胞的活性降低，癌细胞获得自救。这种特殊的蛋白质就是PD-L1(程序性死亡受体-1的配体)。但最新的外泌体分析发现，肿瘤是首先分泌外泌体作为先锋队，通过血液循环系统传送到其他组织，并改造微环境使其适应肿瘤细胞生长后，再排遣肿瘤细胞大军安营扎寨。这一发现再次刷新或颠覆了我们对癌症的认识，百年来关于癌症的“种子”和“土壤”假说终于获得印证。令人振奋的是，最近陈刚副教授在其研究中发现，肿瘤细胞可通过释放表面富含PD-L1的外泌体发挥对肿瘤杀伤性T细胞的功能抑制作用，且外周血中PD-L1阳性外泌体的浓度水平与肿瘤大小呈密切正相关(Nature,2018,560(7718):382-386)。

目前对体液中外泌体的检测主要是借助超速离心法进行外泌体的分离纯化，耗时耗力，不利于临床快速检测。同时现有技术主要是集中分析外泌体表面的四跨膜超家族蛋白(CD63/CD9/CD81等)，正常细胞分泌的外泌体表面也携带四跨膜超家族蛋白，所以目前大多数外泌体检测目的是基于外泌体丰度检测，并不具有特异性。

目前磁免疫化学分析平台方法，整个反应体系集中于离心管中，存在孵育不充分，混合不充分以及磁分离效率低等缺点。

发明内容

本发明解决了现有技术中外泌体检测特异性不高、操作不便和成本高的技术问题，以及磁免疫分离效率低的技术问题。

按照本发明的第一方面，提供了一种PD-L1外泌体的磁免疫化学发光检测试剂盒，所述试剂盒含有抗体A、抗体B、多孔泡沫金属填充的中空柱和磁铁，所述抗体A为化学发光分子或能使底物发光的酶标记的外泌体抗体，所述抗体B为磁珠标记的外泌体抗体；所述抗体A和抗体B中至少有一种为外泌体PD-L1抗体。

优选地，所述多孔泡沫金属为多孔泡沫铁、多孔泡沫钴或多孔泡沫镍；

优选地，所述多孔泡沫金属的孔洞的直径为10um-100um。

优选地，所述化学发光分子为吖啶脂；所述能使底物发光的酶为辣根过氧化物酶。

优选地，所述磁珠为顺磁磁珠，直径为10nm-1000nm。